Resumen: Este trabajo es fruto de una revision bibliografica sobre los principales metodos utilizados en el aislamiento y la elucidadacion estructural de saponinas y sapogeninas esteroidales.
RESUMEN
Este trabajo es fruto de una revisión bibliográfica sobre los principales
métodos utilizados en el aislamiento y la elucidadación estructural de saponinas
y sapogeninas esteroidales.
INTRODUCCIÓN
Las saponinas esteroidales son compuestos que poseen una estructura compleja
formada por un núcleo esteroidal hidrofóbico y una parte hidrofílica constituida
por unidades de monosacáridos. Estas están ampliamente distribuidas en el reino
vegetal y aunque en mayor o menor medida se encuentran en una gran cantidad de
plantas, son especialmente abundantes en algunas familias, entre ellas la
Agavaceae.
Estos compuestos poseen como propiedades comunes la alta capacidad de formación
de espumas en soluciones acuosas, su actividad hemolítica, ser tóxicas para los
peces y la formación de complejos con el colesterol (1,2)
Las saponinas tienen un amplio rango de actividades biológicas tales como su
acción antimicótica (3), antiviral (4), anticancer (5), hipolesterolémica (6),
hipoglicaémica (7), antitrombótica (8), diurética (9), antinflamatoria (10) y
molusquicida (11, 12)
Por hidrólisis de las saponinas se obtienen las sapogeninas esteroidales,de gran
interés para la industria farmacéutica por ser precursores en la síntesis de
hormonas y corticoides.
En los últimos años, el desarrollo de técnicas espectroscópicas modernas de
Resonancia Magnética Nuclear (TOCSY, HMBC, HSQC, HSQC-TOCSY, COSY, NOESY) (13,
14) y de Espectrometría de Masas (ESI y FAB) (15, 16) ha sido de gran ayuda en
el trabajo de caracterización y ha permitido un incremento en el número de
publicaciones referidas a estos metabolitos.
DESARROLLO Estructura
Las saponinas son glicósidos (fig. 1) en los cuales varias unidades de
monosacáridos se enlazan mediante un enlace glicosídico a un resto denominado
aglicón. El aglicón puede ser de naturaleza triterpénica o esteroidal y en
función de esto las saponinas se clasifican en saponinas triterpénicas y
saponinas esteroidales respectivamente.
Fig.1 Ejemplo de saponina esteroidal
El aglicón en las saponinas esteroidales (sapogenina) presenta el esqueleto
tetracíclico característico de este tipo de compuestos, denominado gonano (ciclopentanoperhidrofenantreno)
en el caso de ser saturado.
La característica estructural fundamental de estas sapogeninas radica es la
presencia de dos anillos adicionales que se originan a partir del C-17 del
esqueleto base y están contenidos respectivamente en dos planos perpendiculares
entre sí.
Además, el átomo de carbono común a estos dos nuevos anillos está unido a dos
átomos de oxígeno (estructura de un cetal) por los que a esta “cadena” lateral
se le ha dado el nombre de cadena espirocetálica .
Las sapogeninas pueden clasificarse de acuerdo a la estructura de los anillos E
y F en espirostanos, furostanos y furoespirostanos fundamentalmente, siendo el
primer grupo el más importante (fig. 2). Estos compuestos pueden presentar unión
trans (serie 5a) o cis (serie 5b) entre los anillos A y B, además todos
presentan grupos metilos en C-10 y C-13 dirigidos hacia la cara b de la
molécula. En el caso de que las sapogeninas posean una insaturación entre C-5 y
C-6 se clasifican como D5 espirostanos.
Fig. 2 Ejemplos de espirostanos.
A) 3b-hidroxi-5a, 25R-espirostano.
B) 3b-hidroxi-25S-espirost-5-eno.
Adicionalmente a otros esteroides las sapogeninas presentan centros quirales en
C-22 y C-25, determinando este último dos series para la clasificación de estos
compuestos, la serie "iso" (configuración 25 R) y la serie "neo" (configuración
25 S).
Las saponinas esteroidales poseen de una a seis unidades de monosacáridos unidas
entre sí mediante enlaces glicosídicos. Estas unidades son comúnmente hexosas,
pentosas y deoxihexosas, entre los que se encuentran principalmente glucosa,
rhamnosa, galactosa y xilosa. Los enlaces glicosídicos pueden tener
configuración a o b. Este resto glicosídico, que puede ser lineal o ramificado
en la mayoría de los casos se une con el aglicón a través del C-3 del mismo.
Aislamiento. En la literatura se encuentra una gran cantidad de trabajos en los que se
reportan la extracción de saponinas. En los mismos se aprecia la existencia de
un tronco común en las metodologías utilizadas que se puede resumir en los
siguientes pasos:
a) Proceso de desengrase del material vegetal: El mismo tiene como objetivo
eliminar los compuestos lipídicos que posee la planta, que pueden afectar
operaciones posteriores. El desengrase puede realizarse directamente al material
vegetal o a extractos obtenidos de éste.
b) Obtención del “crudo” de saponinas: Se realiza la extracción del material
vegetal empleando solventes polares tales como metanol, etanol y n-butanol o
mezclas hidroalcohólicas de cada uno de ellos. El n-butanol es muy utilizado por
su especificidad para este tipo de compuestos.
c) Hidrólisis de las saponinas: Generalmente se realiza por vía química
utilizando un ácido mineral como catalizador y su finalidad es liberar las
sapogeninas.
d) Extracción de las sapogeninas liberadas en el proceso de hidrólisis: En este
proceso se utilizan solventes de mediana polaridad como acetato de etilo y
cloroformo.
Los pasos c y d se realizan para obtener las sapogeninas que se encuentran en
forma de glicósidos y proceder a su caracterización como información previa en
la elucidación estructural de las saponinas. En los últimos años, aparejado al
desarrollo de las técnicas de Resonancia Magnética Nuclear, es cada vez más
posible determinar estructuras de estas moléculas sin necesidad de utilizar
métodos destructivos por lo que estas etapas pueden omitirse.
En el aislamiento y purificación de estos compuestos los métodos cromatográficos
juegan un papel decisivo. En la literatura se reporta el uso de la cromatografía
de capa delgada preparativa (CCDP) (17, 18) y cromatografía de columna (CC)
(19). Entre los adsorbentes más utilizados en estas técnicas se encuentran la
alúmina, sílicagel de diferentes granulometrias y más recientemente sephadex LH-20
(20, 21). La cromatografía gaseosa (CG) (22, 23) y más recientemente la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (24, 25) así como las técnicas
de cromatografía de partición a contracorriente RLCC (Rotation Locular
Countercourrent Chromatography) y DCCC (Droplet Countercourrent Chromatography)
(26, 27) se han utilizado con estos propósitos.
En algunos trabajos encontrados en la literatura aparece el uso combinado de
estas técnicas, especialmente en el caso de las saponinas, que por ser altamente
polares y solubles en agua su purificación es una tarea difícil. Ejemplos de
esto último son los trabajos de Fukahara y Kubo (27) en los cuales se logró la
obtención de glicósidos con propiedades alelopáticas combinando técnicas basadas
en la partición y los de Hostettman et al.(26), en los que aíslan saponinas
esteroidales de la corteza del Cornus floridus mediante la utilización combinada
de CC (Filtración por gel utilizando LH-20) y DCCC.
En el aislamiento de saponinas esteroidales de las raíces y corteza de la planta
denominada Balanites aegyptiaca fue utilizada esta última combinación y
comparada con técnicas convencionales de CCD preparativa y CC. Utilizando
sucesivamente la CC con sephadex LH-20 y sílicagel así como la aplicación de
técnicas de HPLC se logró en la misma planta el aislamiento de saponinas de sus
semillas (28).
Elucidación estructural.
Si se cuenta con patrones adecuados la cromatografía de capa delgada es un
procedimiento eficaz para detectar de forma rápida las sapogeninas presentes en
un extracto (29,30) lo cual puede ser corroborado por otros procedimientos. Esta
técnica es menos útil en el caso de las saponinas por no disponerse
comercialmente de patrones de este tipo de compuestos.
De modo general, en todos los trabajos donde se aborda la caracterización de
estos metabolitos se hace uso de técnicas espectroscópicas.
El espectro infrarrojo (IR) de una sapogenina esteroidal posee (31) cuatro
señales características del anillo F que aparecen aproximadamente a 850, 900,
920 y 985 cm-1. Si la intensidad de la señal en 900 cm-1 es mayor que la de 920
cm-1 estamos en presencia de una sapogenina de la serie "iso" (25 S) y en el
caso contrario de una sapogenina de la serie "neo" (25 R). Por otra parte, el
espectro IR nos puede revelar la presencia de determinados grupos funcionales
(OH, CO, etc) que poseen una frecuencia de absorción característica.
La espectrometría de masas (EM) es una técnica que ha tenido amplia aplicación
en el campo de los productos naturales, En el caso de las sapogeninas
esteroidales los trabajos de Budzicbievicz, Djeriaasi y Wiltioms (32) en el año
1962 marcaron pautas para la interpretación de los espectros y el
establecimiento de los caminos de fragmentación de dichas sustancias. El
espectro de masas de una sapogenina esteroidal permite establecer el sistema de
anillos, la naturaleza y posible localización de un sustituyente.
Los espirostanos siguen un patrón de fragmentación en el que el sistema espiro
es el que origina todos los fragmentos importantes, ya sea portando la carga o
eliminándose como un fragmento neutro. En el caso específico de las sapogeninas
podemos considerar que en el ion molecular (Fig. 3) la carga se localiza sobre
uno de los átomos de oxígeno del sistema espiro (A y B), especies estas que
pueden fragmentarse originando los iones oxonio A-1, A-2, B-1 y B-2. Fig. 3 Fragmentación del ion molecular.
La formación de A-1 está favorecida por la existencia de un efecto
estereoelectrónico (33) en el cual, un orbital p de OF que está situado en
posición antiperiplanar respecto al enlace C20 - C22 , asiste a su ruptura.
Cuando el anillo F invierte su conformación, el otro orbital p de OF se sitúa en
posición anti respecto al enlace C22-OE con lo que se favorece la formación de
A-2 (fig. 4). Un análisis similar puede realizarse con el ion molecular B.
Fig. 4 Efectos estereoelectrónicos en la fragmentación del ion molecular
Estos iones producen diferentes fragmentaciones (32) que se encuentran
sólidamente confirmadas por estudios realizados utilizando marcaje con deuterio.
El pico base para un gran número de compuestos entre los que se encuentran la
diosgenina, hecogenina, tigogenina, sarsapogenina y deoxitigogenina tiene un
valor m/e=139 lo cual se deriva de la siguiente fragmentación que muestra la
figura 5.
Fig. 5 Fragmentación
Otra fragmentación importante conduce a una señal en m/e 115 (fig 6).
Fig. 6 Fragmentación
También en estos espectros aparecen señales a m/e 271, 285, 300, 342, 345 y 355
que son producto de procesos similares.
En ocasiones el los espectros de masa ordinarios hay señales que no se observan
o aparecen con muy baja intensidad, lo que dificulta su asignación. Este
problema se ha solucionado con la aparición desde la década de los 80 de nuevas
técnicas (34, 35) para el registro de estos espectros.
Así tenemos la espectrometría de masa por ionización de campo (FI-MS) y
desabsorción en el campo (FD-MS) que son métodos de ionización suave para
sustancias de baja volatilidad; espectrometría de masas por ionización química (CI-MS)
y por bombardeo rápido de átomos (FAB-MS), siendo este último muy utilizado para
ionizar moléculas no volátiles. Actualmente en muchos trabajos donde se reportan
la caracterización de glicósidos (24, 36) se hace uso de estas técnicas,
especialmente del FAB-MS.
En uno de los más representativos (37), investigadores chinos al tratar de
establecer la estructura de un compuesto nuevo, aislado de las raices del
Solanum incanum, no observaron el pico correspondiente al ion molecular al
registrar un espectro de masa ordinario. Al registrar un FAB-EM (modo positivo)
pudieron identificar un pico a m/z 986 que asignaron a [M+H]+ y otros picos
significativos a m/z 882 [M - Pentosa + CHO]+, 720 [m/e 882 - Pentosa - CHO]+,
576 [m/e 720 - Deoxihexosa + CHO]+, 442 [m/e 576 - Pentosa]+ y 397 [Aglicón +
H]+ con lo cual propusieron la siguiente fragmentación (figura 7).
Fig. 7 Fragmentación de un glicósido
La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una técnica muy poderosa y útil en la
caracterización de saponinas y sapogeninas esteroidales.
En la literatura aparecen compilaciones de los corrimientos químicos en los
espectros de RMN 1H de gran cantidad de sapogeninas esteroidales. Se destaca en
la década de los 60, la realizada por K. Tori y K. Aono (38) donde aparecen 155
compuestos y se relaciona la posición de las señales correspondientes a los
metilos en C-18, C-19, C-21 y C-27 que son características de estos compuestos
con la presencia de sustituyentes o insaturaciones en distintas posiciones, así
como se plantean reglas de aditividad para los corrimientos químicos de los
metilos angulares en función de dichos sustituyentes, siempre que no haya
cambios en la estereoquímica del esqueleto esteroidal. Los metilos 18 y 19
aparecen como singletes con corrimientos químicos entre 0,95 y 1,10 ppm y los
metilos 21 y 27 aparecen como dobletes que acoplan con el H-20 y el H-25
respectivamente (J 3=6,5 ,5 ± 0,3 Hz) y corrimiento químico entre 0,78 y 0,80
ppm.
La asignación de las señales en estos espectros se comienza a realizar por las
más desblindadas que son fácilmente identificables y que pertenecen a hidrógenos
enlazados a carbonos con hibridación sp2 o enlazados a un átomo de oxígeno.
También son señales características de estos compuestos las correspondientes a
los H a y b) unidos a C-26 entre 3,30 y 3,5 ppm. El H-26a (axial) aparece como
un triplete alrededor de 3,32 ppm, su multiplicidad se debe a un doble
acoplamiento cuasidegenerado geminal y vecinal axial-axial (J2»J3»10,6 Hz). El
H-26b (ecuatorial) aparece como un doblete de doblete en 3,5 ppm y su
multiplicidad se debe al acoplamiento geminal (J2=10,6 Hz) y vecinal
ecuatorial-axial (Jea3 = 2,6 Hz).
La señal del H-16a aparece como cuarteto en 4,4 ppm y es debida al acoplamiento
con protones 15b (ecuatorial), 15a y 17b (cuasiecuatoriales) (39).
Los estudios de RMN 13C son muy útiles en la elucidación de la estructura de
estos compuestos dada la sensibilidad de la señal al tipo y estereoquímica de
los sustituyentes. En la década del 70, Blunt y Stothers (40) realizaron una
compilación de los corrimientos químicos de los espectros de alrededor de 400
derivados esteroidales. Posteriormente se realizaron otros trabajos de este
tipo, destacándose el resumen presentado por Agrawal y colaboradores (2)
dirigido a saponinas y sapogeninas esteroidales.
En general, los espectros RMN 13C de estos compuestos se registran de forma
desacoplada para evitar el solaplamiento de señales debido a la elevada magnitud
del acoplamiento 13C-1H (120-250 Hz).
En este caso, la asignación se comienza a realizar también por las señales más
desblindadas y otras típicas de estas estructuras que son fácilmente
reconocibles. Las señales diagnósticas de los espirostanos pertenecen al anillo
F y se muestran en la siguiente tabla.
En los D5- espirostanos aparecen señales a 141,2± 0,8 y 121,0± 0,4 ppm asignadas
a C-5 y C-6 respectivamente. La determinación de las constantes de acoplamiento
(JC-H ) nos facilita la asignación de carbonos hidroxilados pues en este caso su
valor es de 142 ± 2 Hz mientras que en el resto de lo átomos oscila de 120 a 130
Hz (2).
Para estos compuestos normalmente no hay afectación en los corrimientos químicos
de los átomos de carbono del anillo F por la presencia de sustituyentes en A, B
y C. La comparación con espectros compilados en la literatura facilita la
asignación del resto de las señales (2).
Muy utilizadas son las técnicas auxiliares DEPT (Distortion Enhacement by
Polarization Transfer), SFORD (Single Frecuency Off Resonence Decoupled), ATP (Attached
Proton Test) e INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced By Polarization Transfer) que
permiten diferenciar los distintos átomos de carbono (CH3, CH2, CH y C
cuaternario) y facilitan la asignación (41, 42).
En los glicósidos, además de caracterizar el aglicón es necesario determinar el
número de monosacáridos y caracterizarlos, lo que se realiza a partir del número
de señales correspondientes a carbonos anoméricos y por comparación con
espectros de azúcares libres.
La forma de conexión entre las distintas unidades de azúcares en quizás la
información más significativa que nos brinda el espectro RMN 13C, la que es muy
difícil de obtener por otras vías. La secuencia de los azúcares puede
determinarse en base a los corrimientos químicos o a la medición de los tiempos
de relajación (t1). Los corrimientos químicos de los monosacárido terminales de
una cadena glicosídica prácticamente no varían respecto a los metil-O-glicósidos
correspondientes. En las unidades de monosacáridos internas la glicolización
provoca un corrimiento de la señal a bajo campo en el carbono a (anomérico) y a
campo alto en el carbono b.
Estos efectos son independientes de la naturaleza del monosacárido y nos brindan
un método para el establecimiento de la conectividad entre las unidades de
azúcares. El resto de las señales de cada unidad no se afectan y pueden ser
comparadas con los metil-O-glicósidos correspondientes. El uso del tiempo de
relajación para este objetivo está basado en que el valor N.t1 (N: población del
estado) para los carbonos de las unidades de monosacáridos se incrementa con la
distancia a que estos se encuentren del aglicón .
Por otra parte, según el valor del corrimiento químico, es posible establecer la
configuración de los carbonos anoméricos por la dependencia que existe entre
ellos.
Por último, comparando los valores de los corrimientos químicos de la saponina
con los de la sapogenina libre correspondiente se puede conocer el lugar del
aglicón en el que se unen los azúcares, por la variación que experimenta este
valor en el carbono unido a un OH (sapogenina), respecto al mismo carbono unido
al resto azucarado (saponina) (2).
Trabajos más recientes (43-45) reportan la utilización de otras técnicas,
particularmente útiles en la asignación de señales correspondientes a los
azúcares. Entre estas se encuentran las de correlación homonuclear HH COSY (Correlation
Spectroscopy) y TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) así como HMQC (Heteronuclear
Multiple Bond Correlation) que permite correlacionar las señales de los
espectros protónico y de carbono así como NOESY (Nuclear Overhauser Effects
Spectroscopy) en la cual la interacción de los protones que correlacionan ocurre
a través del espacio y es útil en el establecimiento de la forma de unión entre
las unidades de monosacáridos.
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AUTORES José Orestes Guerra de León
Doctor en Ciencias Químicas
Profesor Auxiliar del Departamento de Licenciatura en Química.
Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara. Cuba.
jo@uclv.edu.cu
