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Determinacion de anticuerpos antiplaquetarios por inmunofluorescencia indirecta para el estudio de Purpura Trombocitopenica Inmunologica


Enviado por Luis Yuseff Reyes Leyva y Otros Autores
Código ISPN de la Publicación: EEZlFZuVpVyoyxymQY


Resumen: En nuestro trabajo se introduce la tecnica de deteccion de anticuerpos antiplaquetarios (PLA) por Inmunofluorescencia indirecta (IFI) para un mejor diagnostico de la PTI, usando estos anticuerpos como marcadores serologicos diferenciales. Se estandarizaron los parametros optimos de la tecnica, dilucion 1/10, 30 min de incubacion serologica y 45 min con el conjugado fluorescente. Palabras claves: anticuerpos antiplaquetarios, inmunofluorescencia indirecta, Purpura Trombocitopenica Inmunologica.


   

  

RESUMEN
La Púrpura Trombocitopénica Inmunológica (PTI), es una patología de causa desconocida, donde se evidencia una disminución de las plaquetas por debajo de 150 x 109 L. Esta enfermedad tiene antecedentes inmunológicos por la presencia de anticuerpos antiplaquetarios que se dirigen contra las glicoproteínas de membrana (CD62, CD63, CD69, CD41, CD42).(6,7,8,9,13)

En nuestro trabajo se introduce la técnica de detección de anticuerpos antiplaquetarios (PLA) por Inmunofluorescencia indirecta (IFI) para un mejor diagnóstico de la PTI, usando estos anticuerpos como marcadores serológicos diferenciales. Se estandarizaron los parámetros óptimos de la técnica, dilución 1/10, 30 min de incubación serológica y 45 min con el conjugado fluorescente. Los estudios de sensibilidad y especificidad reportaron valores altos en un 82% y un 60% respectivamente, siendo estos aceptados por la literatura y se determinó la relación de los PLA con los ANA, ASA y antieritrocitos, donde no se observaron diferencias significativas entre ellos, lo que evidencia la posibilidad de que estos autoanticuerpos se encuentren presentes en los pacientes aquejados con PTI. 

Palabras claves: anticuerpos antiplaquetarios, inmunofluorescencia indirecta, Púrpura Trombocitopénica Inmunológica.

INTRODUCCION
La Púrpura Trombopénica Inmune (PTI) es una enfermedad caracterizada por la presentación habitualmente aguda de un síndrome purpúrico debido a trombocitopenia periférica que carecen de antecedente u otra patología que explique dicha citopenia. Suele existir antecedente de infección viral 1-3 semanas antes. La exploración física es normal a excepción de la sintomatología hemorrágica, que además de la púrpura cutáneo-mucosa puede incluir epistaxis, gingivorragias, menorragias, hemorragias del tracto gastrointestinal, del tracto urinario y más raramente hemorragia intracraneal, que tiene una frecuencia aproximada del 1% y puede presentarse tanto en pacientes con PTI aguda como crónica; estas manifestaciones hemorrágicas suelen estar relacionadas con la gravedad de la trombopenia.(1,2,4,5,11,13,14)

En los estudios de activación plaquetaria, los anticuerpos monoclonales se dirigen frente a glicoproteínas, que durante la activación modifican su expresión antigénica a nivel de la membrana plaquetaria, tal es el caso de CD62, CD63, CD69, CD41, CD42, los cuales son los antígenos para los que se forman los anticuerpos antiplaquetarios, que pueden ser de tipo IgG e IgM, los cuales provocan una disminución plaquetaria menor de 150 × 109 /L.(6,7,12,14)

La introducción de esta técnica en el Hospital Clínico Quirúrgico “Lucía Iñiguez Landín” para la detección de anticuerpos antiplaquetarios por inmunofluorescencia indirecta (IFI) situaría el nivel diagnóstico de la PTI en nuestro Centro a la altura de las Instituciones Nacionales en las que se realiza el diagnóstico de esta enfermedad por inmunofluorescencia directa (IFD). Esto significaría una mejor atención a pacientes pues para el estudio de esta enfermedad no tendría que viajar a otras instituciones; además es una técnica poco costosa, las antiinmunoglobulinas (en nuestro caso IgG) se obtienen por inmunización de carneros en muy poco tiempo y con pocos recursos.

Por lo antes expuesto y la crítica situación que presentan los laboratorios clínicos en la región oriental del país para el diagnóstico diferencial de PTI, consideramos que con la estandarización de la técnica de detección de anticuerpos antiplaquetarios (PLA) por inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la utilización de plaquetas obtenidas en el Banco de sangre y el conjugado fluorescente con actividad antiinmunoglobulina G (anti-IgG) humana, se obtendrá un mejor diagnóstico diferencial en pacientes aquejados por esta patología autoinmune, con los mismos valores reportados por la literatura.

En el presente trabajo se realiza la estandarización de la técnica de detección de anticuerpos antiplaquetarios séricos por IFI para el diagnóstico de PTI, utilizando un conjugado fluorescente (anti-IgG) humana.

Para esto ha sido necesario:
- Determinar la dilución serológica óptima para la incubación sobre el sustrato antigénico; tiempo de incubación óptimo con la dilución serológica y el conjugado fluorescente.
- Determinar la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos antiplaquetarios para el diagnóstico de la enfermedad estudiada. 
- Analizar la relación de los anticuerpos antiplaquetarios con otros autoanticuerpos. 

MATERIALES Y METODOS.
Reactivos biológicos
Se usaron 52 sueros controles positivos de pacientes con enfermedades hematológicas autoinmunes , (22 sueros de PTI, 18 sueros de Anemia hemolítica autoinmune y 12 sueros de vasculitis ya diagnósticadas, procedentes de las Consultas externas de las Especialidades de Hematología e Inmunología del Hospital Lucía Iñiguez Landín.

20 sueros controles negativos (tomados del Banco de Sangre Provincial de Holguín donde no se detectaron autoanticuerpos).

El conjugado anti-IgG humana marcado con Isotiocianato de fluoresceína, fue sintetizado en el laboratorio de Inmunología de la misma Institución según Normas del Centro de Inmunología y Biopreparados de la Provincia de Holguín para la “Conjugación de sueros hiperinmunes con Isotiocianato de fluoresceína”.

Las plaquetas y los eritrocitos usados como sustrato, para el diagnóstico de la PTI y el estudio de los anticuerpos antieritrocitos, respectivamente, fueron tomadas del Banco de sangre, del Hospital “Lucía Iñiguez Landín.

Los cortes de hígado y esófago de rata de la línea Wistar, usados como sustratos antigénicos para la detección de los anticuerpos antinucleares (ANA) y antiepidérmicos (ASA), fueron realizados por el LABEX, Santiago de Cuba. 

METODOS
La detección de los anticuerpos antiplaquetarios, antinucleares y antiepidérmicos se realizó por la técnica de Inmunofluorescencia indirecta, usando el microscopio de epiiluminación fluorescente (UV) de alta resolución de marca ZEIZZ. (17)

La detección de los anticuerpos antieritrocitos se realizó por la técnica de Coombs directa.

Para determinar la sensibilidad y especificidad se usó la siguiente realción:

Sensibilidad:         (a / a + c) x 100                 donde a: valores positivos con PTI
                                                                              c: valores negativos con PTI

Especificidad:       (d / d + b) x 100                 donde d: valores negativos sin PTI
                                                                             b: valores positivos sin PTI

Para analizar la relación de los PLA con otros autoanticuerpos se determinó la presencia de los ANA y ASA por IFI y FR por micrométodo utilizando un autoanalizador Roche/Hitachi, de las muestras de los pacientes con estas enfermedades diagnosticadas que tenían anticuerpos antiepidérmicos detectados por la misma técnica.

Análisis estadístico.
Se realizó un análisis comparativo de proporciones, mediante el paquete estadístico Microst (1984).Ecosoft. Los datos obtenidos se introdujeron en los modelos correspondientes y a partir de estos se realizó el estudio comparativo entre los diferentes parámetros analizados para la estandarización de la técnica de detección de PLA y la relación de estos con los autoanticuerpos, ANA, ASA y antieritrocitos, usando el estadígrafo Ji-cuadrado.

ANALISIS Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
Se tomaron diluciones seriadas desde 1/10 hasta 1/160, manteniendo el conjugado fluorescente con una dilución de 1/40 como se reporta en la literatura; todos contra un tiempo de incubación mínimo de 30 min., uno medio de 45 min., y el máximo de 90 min.

Se mostró positividad hasta la dilución serológica 1/80, mientras que en la dilución 1/160 no se emitió luz verde. La fluorescencia en comparación con otras diluciones mayores, fue escasa para 1/80, esta última positivó muy tenue (grado I) preferentemente a tiempos máximos de incubación con el conjugado anti IgG humana y con el suero correspondiente.

Sin embargo, en la dilución 1/40, expresó mayor cantidad de réplicas positivas con grado I y II, con relación a la dilución 1/80, el tratamiento con las diluciones 1/10 y 1/20, para todas las réplicas, mostró positividad de grado III y muy pocas de grado II; como era de esperar, a esta dilución, la concentración de autoanticuerpos es suficiente para que logre definir la distribución de la fluorescencia sin interferencia. Sin embargo, se escoge con mayor frecuencia la dilución 1/10 por tener una mayor concentración de anticuerpos que permiten realizar diluciones seriadas para un mejor estudio semicuantitativo de la enfermedad, pues en la mayoría de los casos la concentración de autoanticuerpos se relaciona con el estadío clínico de la patología.

Para los tres tiempos de incubación serológica usados, se observó fluorescencia, pero transcurridos 45 y 90 min. se encontraron patrones moderadamente interferidos por fluorescencia inespecífica, lo que puede estar referido a la exposición de los anticuerpos a otras regiones antigénicas del sustrato, no así para 30 min., en este último la fluorescencia se observó nítida. 

La fluorescencia de las muestras, variando el tiempo del conjugado, se comportó similar a las tratadas con 30 min. de incubación con el sustrato. Los sueros incubados con el conjugado a 30 min. mostraron patrones positivos de grado I, pero con fluorescencia amortiguada, esto se debe a que el tiempo de reacción entre los anticuerpos del suero con la anti-inmunoglobulina G del conjugado es insuficiente para el acople entre ellos. En los casos tratados con 90 min. se observó patrones positivos de grado II y III, aunque con mucha interferencia inespecífica debido al prolongado tiempo de incubación que aumenta la exposición de interacción de otras proteínas del suero con el corte histológico, mientras que con 45 min. no existió fluorescencia inespecífica y se mostraron los patrones positivos con una alta nitidez, siendo éste el tiempo óptimo de acople de los anticuerpos.

Los datos estadísticos reportaron que para las diluciones 1/80 y 1/40 se obtuvieron diferencias significativas con valores de probabilidad de .0021 y .0018 respectivamente, por lo que no se recomienda usar estas diluciones como trabajo; mientras que para las 1/20 y 1/10 no se observaron diferencias con valores de .246 siendo estas las usadas generalmente y reportadas por la literatura, pero se recomienda usar 1/10 pues es donde existe mayor cantidad de anticuerpos y se pueden hacer varias diluciones seriadas.

En el tiempo de incubación con el suero se reportaron valores de .002 con relación a 90 minutos resultando diferencias significativas con respecto a 30 min; mientras que entre los 30 y 45 min no se observaron diferencias con valor de .0561, siendo estas las usadas en los laboratorios, pero se usa generalmente 30 min porque no existen interferecnias inespecíficas como resulta a los 90 min.

En relación al tiempo de incubación con el conjugado fluorescente se obtuvieron diferencias entre los 30 y 45 min con valor de .003; mientras que en relación a los 90 min no se reportaron valores de diferencias . 012, pero se escoge 45 min por ser el reportado por la literatura. 

DETERMINACION DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
En las investigaciones realizadas se encontraron que de 22 pacientes diagnosticados como enfermos de PTI, 18 de ellos mostraron positividad para los anticuerpos antiplaquetarios con grado II y III; 4 no emitieron fluorescencia. El grupo que comprende las otras enfermedades se trataron con los mismos sustratros, al igual que los controles negativos.

Los PLA fueron los anticuerpos con mayor incidencia en la PTI, reporténdose valores de sensibilidad de 82% y especificidad 60%, siendo estos los marcadores serológicos por excelencia en el diagnóstico de la PTI.

Los ANA generalmente muestran positividad en la PTI() . De los 22 pacientes con PTI, estuvieron fluoresciendo con patrones homogéneos y granulares, 11 de estos, que permite explicar la presencia de los anti-DNA en esta patología; además de los antígenos ENA, también pueden estas presentes en este orgánulo celular y positivar para estos anticuerpos.(1,2) Se reportó una sensibilidad de 50% y un 43% de especificidad.

Tabla.1. Estudio de la sensibilidad y especificidad clínica de los anticuerpos antiplaquetarios en comparación con otros autoanticuerpos. El mayor por ciento de sensibilidad y especificidad se corresponde a los anticuerpos antiplaquetarios, lo que le confiere las características de ser marcadores serológicos de la PTI. 



La sensibilidad y especificidad de los ASA fue de 41% y 57% respectivamente, lo que avala que estos anticuerpos tengan una relación con los PLA y el desarrollo de la PTI, pues en investigaciones realizadas han encontrado la presencia de estos anticuerpos en el endotelio vascular, formando inmunocomplejos, que traerían consigo el retenimiento de los cuagulos sanguíneos y la atracción de células efectoras del sistema inmune, las cuales harían daños al endotelio y a las plaquetas, provocando la formación de los PLA.(11,12,14,16)

Los anticuerpos antieritrocitos tienen también una estrecha relación con la PTI, pues los valores de sensibilidad 55% y especificidad 37%, muestran dicha relación, pues en estos pacientes frecuentemente se encuentran estos anticuerpos ligados a los PLA.(8,9,13,15,16) 

Relación de los PLA con otros autoanticuerpos.
En la mayoría de las enfermedades autoinmunes existe una variada gama de autoanticuerpos y frecuentemente se zolapan. El carácter diagnóstico de estas moléculas varían, muchos son solo maracadores serológicos pero otros son agentes mediadores de las enfermedades.(1,2,4,5,10)

Entre los PLA y los ANA existe una estrecha relación, se observó que de los 18 pacientes con PLA positivos, 10 positivaron para los ANA; mientras que las muestras negativas para los PLA solo 1 positivo en los ANA. Esto evidencia la presencia de los ANA en la PTI y la relación con los PLA, observese los valores de sensibilidad y especificidad en la Tabla.1.

El estadígrafo χ2 reportó un valor de .16 con una p=.42 no existiendo diferencias significativas entre estos autoanticuerpos, por lo que se puede plantear que ambos anticuerpos pudieran estar presentes en esta patología. 

En la PTI se ha reportado la presencia de anticuerpos, como los PLA y ASA contra el endotelio vascular y las glicoproteínas de las plaquetas respectivamente.
Los resultados reportaron que de los 12 pacientes con PTI, 9 positivaron para los ASA, estando en 50%, mietras que para los negativos para PLA no positivaron en relación con los ASA. El análisis estadístico arrojó un valor de χ2= 1.04 con la p=.64, donde al igual que el caso anterior no tuvieron diferencias significativas, estos resultados se verifican por la presencia de ambos anticuerpos en la enfermedad y por los valores reportados en la Tabla. 1

Los anticuerpos antieritrocitos van dirigidos contra las glicoproteínas de la membrana celular y generalmente se encuentran en las anemias autoinmunes. En nuestra investigación de las 18 muestras positivaron 12, siendo esta una cifra relevante, evidenciando la presencia de estos en las PTI en la mayoría de los casos. De las muestras negativas para PTI, ninguna positivó para los antieritrocitos.

El valor de χ2=.83 con una p=.56 no arrojó diferencias significativas entre ambos anticuerpos, por lo que ambos pudieran estar presente en los pacientes aquejados con PTI.

CONCLUSIONES
1.. La dilución serológica óptima que se determinó para el acoplamiento de los anticuerpos antiplaquetarios al sustrato antigénico fue de 1/10, lo que indica que a este título se encuentra la mayor cantidad de anticuerpos que realizan interacciones efectivas con el antígeno sin interferencia inespecífica e incubado durante 30 min., y 45 min. con el conjugado fluorescente.
2.. La detección de los anticuerpos antiplaquetrios por Inmunofluorescencia indirecta reportó una Sensibilidad y Especificidad de 82% y 60%, respectivamente, lo cual avala al método como útil para el diagnóstico de PTI en comparación con la Sensibilidad y Especificidad de la determinación de ANA y ASA por el mismo método.
3.. La relación de los PLA con los autoanticuerpos estudiados (ANA, ASA y antieritrocitos) no mostraron diferencias significativas , lo que indica que en un mismo paciente con PTI pueda presentar autoanticuerpos contra los núcleos de sus células, contra las células epiteliales de los endotelios vasculares y contra los eritrocitos, pudiendo ser estos autoanticuerpos marcadores serológicos de esta patología.
4.. La introducción de la técnica de detección de los PLA por IFI en pacientes con PTI, permitió estandarizar un método diagnóstico diferecial de estas enfermedades hematológicas autoinmunes, ajustados a las condiciones de nuestro laboratorio. 

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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16. Catálogo sobre inmunofluorescencia indirecta. Biosystems Reagents & Instruments. 2003.

Hospital General “Lucía Íñiguez Landín”

AUTORES
1- Eddie Batista Riacardo 
2- Luis Yuseff Reyes Leyva
3- Maria Antonia Escobar Balboa

1. Licenciado en Biología. Profesor instructor. Departamento de inmunología. Laboratorio clínico. Hospital General “Lucía Iñiguez Landín”.
2. Licenciado en Química. Profesor instructor. Departamento de inmunología. Laboratorio clínico. Hospital General “Lucía Iñiguez Landín”.
3. Dra en medicina. Especialista de primer grado en Laboratorio clínico. Profesor asistente. Laboratorio clínico. Hospital General “Lucía Iñiguez Landín”.
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Responsable: LuisYuseff Reyes Leyva.
Dirección: Calle 25 No.53 entre Adel Calderón y Manuel Angulo. Rpto 26 de Julio. Holguín.
Teléfono: 42 7911
Email: yuseff@hcqho.sld.cu


Enviado por Luis Yuseff Reyes Leyva y Otros Autores
Contactar mailto:hperez@fh.uho.edu.cu


Código ISPN de la Publicación: EEZlFZuVpVyoyxymQY
Publicado Saturday 5 de May de 2007