RESUMEN
Durante la germinación y los primeros días de crecimiento de la plántula, ocurren numerosos procesos fisiológicos, en los que la presencia de una sustancia tóxica o la concentración elevada de nutrientes puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal del vegetal. En este estudio se evaluó la influencia de un lodo anaerobio líquido propuesto para su uso como fertilizante en alternativa a los nocivos agroquímicos, sobre la emergencia y los primeros estadios de crecimiento de plantas terrestres, cultivadas en condiciones óptimas de crecimiento, siguiendo la normativa de OECD (Organization for Economical Cooperation and Development), en su protocolo 208 de abril 1984, modificado. Luego del tratamiento de tres grupos de plantas (sorgo, lechuga y rábano), con sustancia pura a prueba (100%) y diluciones de esta (25, 50, 75), se comprobó su inocuidad y sus potencialidades como estimulante del crecimiento. Sin embargo, el análisis morfológico arrojó que por encima del 50%, la elevada concentración de nutrientes provocó evidentes malformaciones en estructuras primordiales de los vegetales tratados.

Palabras claves: biofertilizante, evaluación toxicológica, malformaciones en estructuras primordiales. 

EVALUATION OF THE TOXICITY OF A ANAEROBE MUD IN TERRESTRIAL PLANTS
ABSTRACT 
In the plants, during the germination and the first days of growth they happen numerous physiologic events, in those the presence of a toxic substance or a high concentration of nutrients can interfere altering the survival and the normal development of vegetable. In this study, following the OECD (Organization for Economical Cooperation and Development) normative in its protocol 208 (april, 1984), was evaluated the influence of a liquid anaerobe mud proposed for its use as fertilizer in alternative to the noxious agrochemicals, on the emergency and the first days of growth of terrestrial plants, cultivated under good growth conditions. After the treatment of three groups of plants (sorghum, lettuce and radish), with the pure substance (100%) and their dilutions of (25, 50, 75), we prove their innocence and their potentialities as stimulant of the vegetable growth. However, the morphological analysis hurtled that above 50%, the high concentration of nutrients caused evident malformations in primordial structures of the treaties vegetables.
Key words: biofertilizer, toxicological evaluation, malformations in primordial structures. 

INTRODUCCIÓN
Los suelos vírgenes suelen contener cantidades adecuadas de todos los elementos necesarios para la correcta nutrición de las plantas. Pero cuando una especie determinada se cultiva año tras año en un mismo lugar, el suelo puede agotarse y ser deficitario en uno o varios nutrientes. En tal caso, es preciso reponerlos en forma de fertilizantes. Como fertilizante o abono se conoce a sustancias o mezclas químicas (naturales o sintéticas) utilizadas para enriquecer el suelo y favorecer el crecimiento vegetal.

Las plantas no necesitan compuestos complejos, del tipo de las vitaminas o los aminoácidos, pues sintetizan todos los que precisan. Sólo exigen una docena de elementos químicos, que deben presentarse de forma tal que la planta los pueda absorber. Los tres elementos que deben contener casi todos los fertilizantes son: nitrógeno, fósforo y potasio aunque en ocasiones, es preciso añadir a éstos pequeñas cantidades de boro, cobre y manganeso.

Debido al incremento en el costo de los fertilizantes químicos y a la contaminación que algunos provocan en el ambiente cuando se utilizan irracionalmente, es necesario encontrar nuevas alternativas de fertilización, económicas y más eficientes. Se considera como una alternativa viable la utilización de las fuentes orgánicas locales y regionales que tradicionalmente se han subutilizado, entre las que destacan las excretas animales.

Las excretas contienen nutrientes que los cultivos pueden utilizar, pero también poseen altas concentraciones de coliformes fecales que producen enfermedades infecciosas. Por ello, para utilizarlas como fertilizantes, es necesario darles un tratamiento de biodigestión que elimine estos agentes y se reduzca así la contaminación ambiental al convertir los excrementos en residuos útiles y sin riesgo de transmisión de enfermedades (McCaskey, 1990). 

La digestión anaerobia es un proceso complejo desde el punto de vista microbiológico; al estar enmarcado en el ciclo anaerobio del carbono, es posible en ausencia de oxígeno, transformar la sustancia orgánica en biomasa y compuestos inorgánicos en su mayoría volátiles: CO2, NH3, H, S, N2 y CH4 (Soubes, 1994). Como principales ventajas se conoce que: se optimiza el material orgánico utilizado, ya que se captan todos los productos y subproductos (gases y líquidos con sólidos disueltos) generados en la degradación, por lo cual existe poca pérdida de elementos nutritivos, cosa que no sucede en la biodegradación aerobia, y por demás los residuos orgánicos obtenidos después de la biodegradación anaerobia (efluente) tienen mayor riqueza nutricional que los obtenidos en la biodegradación aerobia (Noyola y Monroy, 1994). El efluente no posee mal olor, a diferencia del estiércol fresco, tampoco atrae moscas y puede aplicarse directamente al campo en forma líquida, en las cantidades recomendadas (McCaskey, 1990). De acuerdo con Mandujano 1981, un metro cúbico de bioabono producido y aplicado diariamente, puede fertilizar más de 2 ha de tierra por año y proporcionar hasta 200 kg N/ha de los que estarán disponibles en el primer año entre 60 y 70 kg. Además el bioabono no deja residuos tóxicos en el suelo y eleva la calidad del mismo. 

Aunque esenciales para la agricultura moderna, el abuso de cualquier fertilizante puede ser nocivo para las plantas, los cultivos y el suelo. La lixiviación de los nutrientes puede causar contaminación del agua y alteraciones como la eutrofización o desarrollo excesivo de la vegetación.

En este estudio se plantearon los siguientes objetivos: determinar los posibles efectos de la sustancia en estudio sobre la emergencia (CL50) y el crecimiento (CE50) de variedades de plantas terrestres luego de la incorporación al suelo en una aplicación única; registrar la ocurrencia o no de alteraciones de tipo morfológicas en las estructuras esenciales de las plántulas tratadas; emitir un criterio presuntivo de toxicidad del producto a evaluar. 

MATERIALES Y MÉTODOS
Los ensayos de toxicidad se realizaron en el laboratorio de ecotoxicología de TOXIMED en el período comprendido entre noviembre y diciembre de 2004.
Ensayo 1: Test de Lactuca sativa (120h de exposición)

Se realizó un ensayo de toxicidad aguda (120 h de exposición) en el que se evaluaron los efectos fitotóxicos de un lodo anaerobio líquido puro, producto de la fermentación de estiércol vacuno en el proceso de germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Se probaron un control (agua corriente pH 6,9) y 6 concentraciones: 3, 8, 20, 50, 75, 100% (tratamientos), usando como solvente agua corriente. Como puntos finales para la evaluación de los efectos, se determinó la CE/CIg 50 (concentración efectiva a la cual se produjo inhibición de la germinación al 50% respecto al grupo control); la CE/CIr 50 (concentración efectiva a la cual se produjo inhibición en la elongación de la radícula al 50% respecto al grupo control) y la CE/CIh 50 (concentración a la cual se produjo inhibición en la elongación del hipocótilo al 50% respecto al grupo control). 

Ensayo 2: Test de crecimiento de plantas terrestres (suelo natural) 
Se realizó siguiendo la metodología propuesta por la OECD (1993), en el protocolo 208 del 4 de Abril de 1984, “Ensayo de Crecimiento de Plantas Terrestres”, donde se determinaron los posibles efectos tóxicos del lodo anaerobio sobre la emergencia de semillas y sobre los estadios tempranos de crecimiento de plantas de sorgo, lechuga y rábano (seleccionadas por su importancia ecológica, económica y su elevada sensibilidad), después de una aplicación única directa al suelo. Las semillas utilizadas fueron de calidad comercial certificada, suministradas por la Empresa Provincial de Semillas Varias del MINAGRI de Santiago de Cuba. 

Se probaron un control y cuatro concentraciones: 25, 50, 75, 100% (tratamientos), en bloques aleatorios diseñados con 3 réplicas por tratamiento. En cada réplica se plantaron 10 semillas, después de incorporada la sustancia a prueba al suelo natural (sin esterilizar, pH= 7 y 3% de materia orgánica), certificado por el Instituto de Suelos del MINAGRI.

La plantación se realizó en recipientes de vidrio de 9.5 cm de diámetro x 11.5 cm de altura, se rellenaron con 500g del suelo natural, manteniéndolo a una humedad de un 60-70% de saturación. La temperatura ambiental relativa se mantuvo entre los 25 y 27ºC día/23-25ºC noche. 

En este ensayo, se determinó la CE 50 como la concentración a la cual el cambio en el crecimiento es el 50% del crecimiento del grupo control; la CL 50 como la concentración a la cual el cambio en la emergencia es el 50% de la emergencia del control. El crecimiento se expresó en términos de peso húmedo de las plantas y la emergencia se refiere a la presencia de las plántulas sobre la superficie del suelo. 

Tratamiento estadístico:
Para el cálculo de los valores medios, porcentuales y las concentraciones efectivas CE 50 y CL50 se empleó el programa Microsoft Excel. Las variables CE 50 y CL50 se calcularon a partir del estadígrafo Pronóstico el cual calcula o predice un valor futuro en una tendencia lineal usando valores existentes. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Test de Lactuca sativa (120h de exposición)
En el ensayo de toxicidad aguda basado en el test de Lactuca sativa, se obtuvo un 90 % de germinación de los controles, lo que valida la prueba.

En la dilución de la sustancia correspondiente al 3% se observó estimulación de la germinación y el crecimiento general de las plántulas tratadas. Un comportamiento similar resultó para la elongación de la radícula y del hipocótilo la exposición al 8%, ver Figura 1. 

Las principales anomalías en el sistema radicular y apical comenzaron a observarse a partir de la dilución correspondiente al 20%, siendo máximas en la mayor concentración probada. A continuación se listan las más notables.

En el sistema radicular: 
· raíces raquíticas;
· raíces atrofiadas;
· geotropismo negativo.

En el sistema apical:
· hipocótilo corto y grueso o ausente;
· hipocótilo curvado formando un lazo;
· hipocótilo retorcido formando un espiral;
· cotiledones hinchados y en ocasiones con presencia de manchas oscuras.

Estos defectos estuvieron acompañados de valores crecientes de inhibición de la elongación de la radícula y del hipocótilo. En cuanto al porcentaje de germinación la mayor inhibición ocurrió en las concentraciones superiores, ver Figura 1.

En la Figura 2 (gráficos 1; 2; 3) muestran los valores de concentración estimados, correspondientes al 50% de inhibición de la elongación radicular (CE/CIr 50), del hipocótilo (CE/CIh 50) y de la germinación (CE/CIg 50).

Figura 1. Respuesta de las semillas de Lactuca sativa frente a las concentraciones en estudio. Control; 3; 8; 20; 50; 75; 100%, de izquierçda a derecha.

Figura 2. Valores de concentración estimados, correspondientes al 50% de inhibición de la elongación radicular (CE/CIr 50), del hipocótilo (CE/CIh 50) y de la germinación (CE/CIg 50).

La Figura 3 muestra el detalle de las principales anomalías registradas.
Figura 3. Detalle de las principales anomalías. Arriba: plántula con un desarrollo normal. Debajo: principales malformaciones observadas a partir de la dilución correspondiente al 20%: 1 Geotropismo negativo; 2 Hipocótilo corto y grueso-cotiledones hinchados; 3 y 4 Hipocótilo formando un espiral. En todos los casos, raíz primaria defectuosa por atrofia y raquitismo.

Ensayo de crecimiento de plantas terrestres en suelo natural 
Al finalizar el ensayo, en la totalidad de los controles se obtuvo una emergencia igual o superior al 80% del total de semillas plantadas, con crecimiento normal y libre de malformaciones, por lo que se considera válida la prueba. 
A continuación se muestran los resultados obtenidos para cada especie en las Tablas 1 a la 6 y las Figuras 4 a la 6.
En general no ocurrieron variaciones de trascendencia en los parámetros analizados (crecimiento y emergencia) en las plántulas tratadas con respecto al comportamiento de los controles aunque los registros de malformaciones con el aumento de la concentración concuerdan con los resultados obtenidos en el ensayo 1.
Sorgo (Sorghum bicolor)
Tabla 1. Resultados del crecimiento de las plántulas de sorgo