Resumen
Los modelos de enfermedades cerebrovasculares son útiles en el estudio de la enfermedad en el hombre y en la evaluación de posibles medicamentos contra ellas. El gerbil de Mongolia ha sido utilizado en modelos de isquemia cerebral global. Se les provocó isquemia en un hemisferio cerebral mediante la oclusión permanente de una carótida, y en ambos hemisferios a través de la oclusión de ambas carótidas durante 5 minutos a gérbiles de 3 y 12 meses de edad en ambos sexos. A las 24 horas de la oclusión unilateral permanente se determinaron los signos clínicos de infarto cerebral. En ambos modelos se evaluó la conducta exploratoria espontánea mediante el conteo de los empinamientos en un recipiente cilíndrico, un día antes y 7 días después de la operación. Se encontró una pérdida de la habituación en animales de mediana edad (12 meses) y en los machos una semana después de la ligadura permanente de una carótida, así como en hembras adultas después de una semana de la isquemia transitoria. En este último modelo, los animales adultos de ambos sexos mostraron alteraciones en la memoria, lo cual nos permite proponer que los animales jóvenes no sean utilizados como modelo en evaluaciones de este tipo, donde se persigue reproducir un estado clínico semejante al del ser humano, en la enfermedad cerebrovascular oclusiva. 

Palabras clave: gerbil, modelos, isquemia, edad, sexo

Abstract
Models of cerebrovascular diseases are useful in the study of these diseases in man and also in the evaluation of putative drugs against them. Mongolian gerbil has been widely used in global brain ischemia models. In this study, it was produced unilateral ischemia occluding a common carotid artery permanently and in both hemispheres through the bilateral occlusion of carotids during 5 minutes to 3- and 12-month old gerbils of both genders. Twenty two hours after permanent unilateral occlusion, the clinical signs of brain infarction were determined. In both models, spontaneous exploratory behavior was measured by means of the rearing counts in a cylindric recipient, one day before and 7 days after surgery. A loss of habituation was found in middle-aged animals, as well as in males, one week after the one-side permanent carotid ligation. In middle-aged females, the loss of habituation was found a week after 5 minute-bilateral carotid occlusion. In this model, male and female adult animals showed impairments in the memory. These results allows us to propose that adult animals younger than one year old has not be used for this type of models, where is proposed to reproduce a similar to human clinical situation in the occlusive brain vascular disease. 

Key words: gerbil, model, ischemia, age, gender

Introducción
Las enfermedades cerebrovasculares constituyen la tercera causa de muerte en nuestro país y la primera causa de discapacidad. Dentro de ellas, la enfermedad cerebrovascular isquémica constituye la componente de mas incidencia y prevalencia epidemiológica. Las investigaciones dirigidas al estudio de la isquemia cerebral comprenden las investigaciones llevadas a cabo en modelos experimentales en animales superiores, fundamentalmente en roedores. La similitud estructural en el árbol vascular entre los roedores y el hombre, y las analogías demostradas en la fisiopatología del daño cerebral isquémico en los mamíferos en general, hacen compatibles los resultados obtenidos en estos estudios con la situación clínica que se pretende abordar. 

Las investigaciones que se realizan actualmente a nivel mundial en la temática de las enfermedades cerebrovasculares, siguen dos direcciones fundamentales: una dirigida al conocimiento de la fisiopatología de estas enfermedades y otra que se orienta al desarrollo de agentes y procedimientos terapéuticos para disminuir los índices de mortalidad y de discapacidad. En ambas direcciones, el aporte conferido por los modelos animales ha sido decisivo.1

Sin embargo, una de las causas de la disparidad que se observa en los resultados de los ensayos clínicos y los ensayos preclínicos radica en el hecho de que ningún modelo hasta ahora reproduce fielmente los hallazgos observados en la enfermedad cerebrovascular humana.2 La mayor parte de los modelos utiliza animales jóvenes y saludables a los cuales se impone la oclusión artificial de una arteria. En la clínica, los pacientes acuden después del establecimiento de los síntomas, por lo general con un deterioro manifiesto de su árbol vascular y con una historia asintomática de cambios que se han ido produciendo, imposible de precisar.3 Dentro de los pacientes comprendidos dentro de las cifras de prevalencia en la enfermedad cerebrovascular isquémica, la proporción mayoritaria está compuesta por individuos en la tercera edad, o sea, mayores de 60 años. Por otra parte, la mayor parte de los estudios experimentales utiliza modelos donde se emplean animales machos,4 con el argumento de que los estrógenos tienen un efecto protector durante el período fértil de las hembras, tal y como sucede en el ser humano.5 Por lo tanto, la respuesta de las hembras al insulto isquémico estaría influida por los niveles de estrógeno en sangre, determinados por el momento del ciclo estral en que se encuentra cada individuo en el grupo experimental correspondiente. Esto debe introducir una variabilidad entre individuos que dificulta la interpretación de los resultados. Sin embargo, en los ensayos clínicos donde se evalúa la eficacia terapéutica, se enrolan pacientes de ambos sexos. 

Por estas y otras razones entendemos que los modelos experimentales de isquemia cerebral deben y pueden perfeccionarse. La selección de la edad y el sexo adecuados en el animal de experimentación donde se modela la isquemia cerebral debe tener un peso sustancial en las inferencias que se hagan en la evaluación de agentes terapéuticos de uso potencial en la clínica.

Los modelos de isquemia global reproducen los accidentes tromboembólicos extracraneales, el paro cardiaco y el colapso vascular sistémico6. Se fundamentan en la oclusión de las vías de entrada de sangre al cerebro: las arterias carótidas y las vertebrales. El gerbil de Mongolia, por tener un polígono de Willis incompleto, desarrolla isquemia en un hemisferio cuando se ocluye la respectiva carótida, y en todo el prosencéfalo cuando se ocluyen ambas7. Esta característica lo convierte en un animal idóneo para este tipo de modelos, que han sido utilizados en investigaciones desde los años 70.8

Atendiendo a las consideraciones mencionadas, hemos intentado desarrollar los modelos de isquemia global en el gerbil de Mongolia, con el objetivo de hacerlos más eficientes en la evaluación de posibles neuroprotectores. 

Materiales y Métodos
Se utilizaron gérbiles de Mongolia (Meriones unguiculatus, CENPALAB) de ambos sexos en condiciones estándar de medio ambiente, alimentación e iluminación, de 3 y 12 meses de edad. 

Modelo de Isquemia unilateral permanente. Mediante un abordaje cervical ventral en el gerbil anestesiado, se aísla la carótida común derecha. La arteria fue ligada en dos puntos y posteriormente seccionada entre estos. A los animales del grupo control se les aisló la carótida sin ligarla o seccionarla. A las 24 horas de la ligadura de la carótida, cada animal fue inspeccionado para determinar la presencia de signos clínicos de infarto, tales como ptosis palpebral, hipotonía e hiporeflexia de los miembros contralaterales, asimetría postural, asimetría en la marcha y muerte. Con estos signos se elaboró un puntaje que permite clasificar a los animales de acuerdo al grado de afectación.

Modelo de Isquemia bilateral transitoria: La cirugía sigue un procedimiento semejante a la isquemia unilateral permanente con la diferencia de que se aislaron ambas carótidas y posteriormente se ocluyeron con clips durante 5 minutos a 37°C. Los animales sobrevivieron una semana sin daño neurológico aparente. 

Para la evaluación funcional en ambos modelos se utilizó la actividad exploratoria espontánea desarrollada un día antes y una semana después de la ligadura permanente de la carótida. Cada gerbil fue colocado en el centro de dicha caja y los empinamientos que hacen los roedores sobre sus patas traseras para explorar un recipiente nuevo fueron contados en un intervalo de 9 minutos, divididos en 3 tercios de 3 minutos cada uno. Como recipiente se utilizó una caja cilíndrica vertical de 30 cm de diámetro y 25 cm de altura. La proporción de empinamientos en cada tercio permitió elaborar una recta de mejor ajuste, cuya pendiente fue utilizada para las comparaciones entre grupos (prueba U de Mann y Whitney) y entre antes y después de la cirugía (prueba de rangos pareados de Wilcoxon).

A los 7 días los animales fueron perfundidos a través del ventrículo izquierdo con solución salina y formaldehído al 4% en PBS a pH 7.0. Los cerebros fueron extraídos y mantenidos en esta solución algunos días. Posteriormente fueron incluidos en parafina, seccionados a 8 mm y teñidos con hematoxilina y eosina. Las secciones fueron inspeccionadas por microscopía óptica. Se determinó la presencia de daño celular, gliosis, necrosis, edema y pérdida neuronal en el sector CA1. la expresión de manifestaciones histopatológicas en los grupos relacionados fue comparada mediante la prueba de independencia de chi cuadrado. 

Resultados
Isquemia unilateral permanente:
La oclusión permanente de la carótida derecha produjo un patrón de signos clínicos de infarto similar para los cuatro grupos de animales (n = 16 en cada grupo). No se encontraron diferencias entre grupos en la mortalidad (p = 0.12 en la prueba de independencia de chi cuadrado) ni en el puntaje (p = 0.86 en el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal - Wallis). 

En cuanto a la conducta de habituación observada a los 7 días de la oclusión, se observó que las pendientes de adultos hembras y machos isquémicos es mayor que las de sus respectivos controles (Fig. 1) (p = 0.01 y 0.001 respectivamente, en la prueba U de Mann y Whitney). 

Además, la incidencia de animales isquémicos que disminuyen la pendiente de la curva de habituación no es diferente de los controles (p = 0.09). Sin embargo, en los animales adultos, esta incidencia es significativamente mayor que en los respectivos controles. Dentro de los animales adultos, los machos presentan la frecuencia mayor (Fig. 2). Estos resultados sugieren que los adultos son capaces de recordar el ambiente del cilindro explorado una semana antes, pero cuando son deprivados de una carótida desarrollan una disfunción cognitiva en esta conducta, relacionada con el aprendizaje y la memoria a corto y mediano plazos. 

Los hallazgos histopatológicos se pueden resumir en la tabla 1. La comparación entre las proporciones mediante la prueba de la probabilidad exacta de Fischer mostró fundamentalmente diferencias entre machos y hembras. Puede decirse con un nivel de confianza mayor al 95% que en las hembras adultas hay más incidencia de picnosis que en las jóvenes (p = 0.04). Entre los jóvenes, los machos presentan más picnosis que las hembras (p = 0.02). Tanto la gliosis, como el daño celular, como la pérdida neuronal, incidieron más en machos que en hembras (p = 0.02; p = 0.03; p = 0.03 respectivamente). 

Isquemia bilateral transitoria:
Tanto los adultos hembras como los machos tuvieron un incremento en el valor de pendiente (una pendiente más próxima a 0) después de una semana de reperfusión (Fig. 3) (p = 0.01 y 0.03 respectivamente, en la prueba de rangos pareados de Wilcoxon). Al mismo tiempo, las hembras adultas sometidas a isquemia tienen una menor pendiente en el post operatorio que sus controles (Fig. 4) (p = 0.008 en la prueba U de Mann y Whitney). Por su parte, la frecuencia de adultos donde disminuye la pendiente es mayor en isquémicos que en controles adultos. Esta significación se obtuvo también para adultos hembra (Fig. 5) (p = 0.01 en la prueba de chi cuadrado). 

Discusión
El modelo de isquemia unilateral permanente comprende el seguimiento de la incidencia de infarto cerebral histológico y clínico en el periodo agudo, así como el surgimiento de disfunciones cognitivas inducidas por la isquemia en la etapa crónica. En este modelo se produce una disminución del flujo sanguíneo en un hemisferio cerebral que produce la muerte de algunos individuos en los primeros días posteriores a la oclusión de la carótida correspondiente. En los individuos sobrevivientes encontrado evidencias de hipoperfusión crónica donde las evidencias de daño estructural y funcional son más notables al cabo de una semana. En la etapa aguda no se encontraron diferencias entre grupos en la mortalidad ni en el factor de vulnerabilidad, que involucra signos motores, somatosensoriales y autonómicos de infarto cerebral. Sin embargo, los resultados muestran la presencia de disfunciones cognitivas en los animales adultos sobrevivientes. Estas disfunciones, expresadas en la pérdida de la habituación en la conducta de actividad exploratoria espontánea, se han desarrollado a lo largo de una semana con un flujo sanguíneo cerebral disminuido en el hemisferio correspondiente a la deprivación de la carótida. Dentro de los gérbiles adultos, los machos parecen ser los más sensibles, de acuerdo a los resultados del deterioro cognitivo, así como de la aparición de alteraciones histopatológicas. 

En cuanto al modelo de isquemia bilateral transitoria, se sabe que en él se produce daño cerebral debido al fenómeno de isquemia-reperfusión. Después de un episodio de isquemia suficientemente largo (5 minutos) la recirculación induce la aparición de reacciones mediadas por radicales libres de oxígeno, que provocan un daño adicional. En este caso, los gérbiles adultos parecen ser más vulnerables al daño por reperfusión, de acuerdo a la disminución del valor de la pendiente durante la semana de reperfusión. La comparación entre grupos en esta segunda determinación muestra una mayor vulnerabilidad en las hembras que en los machos.

La protección cerebral inducida por estrógenos está ampliamente documentada en la literatura especializada.9,10,11 En cambio, los reportes acerca de una mayor vulnerabilidad en uno u otro sexos sigue siendo escasa. No conocemos de estudios previos donde se haya investigado simultáneamente el efecto de la edad y del sexo en animales sometidos a isquemia cerebral. En nuestro caso, encontramos que en el gerbil de Mongolia, los individuos de mediana edad son más vulnerables a la disminución del flujo sanguíneo cerebral en un hemisferio, así como al daño cerebral por isquemia reperfusión en ambos hemisferios. La información disponible nos permite suponer un nivel de protección atribuible a los estrógenos en las hembras adultas sobrevivientes a la ligadura permanente de una carótida. Resulta sorprendente el hallazgo de evidencias de alteraciones conductuales en las hembras adultas sometidas a isquemia-reperfusión, que no se observan en los machos de esa edad. Los resultados sugieren una pérdida de la protección mediada por estrógenos hacia la mediana edad en el período de reperfusión. Es preciso tener en cuenta que las hembras de esta especie conservan su actividad reproductiva al año de edad, si bien comienza a disminuir la frecuencia de las gestaciones y el número de crías a partir de este momento. Los reportes que muestran un efecto protector más evidente por parte de los estrógenos son aquellos donde la hormona es administrada por vía oral o subcutánea.10, 11,13 De todas formas, resulta aventurado proponer conclusiones acerca del efecto neuroprotector de los estrógenos endógenos sin una medición directa de los niveles hormonales individuales. 

Por otra parte, la utilización de animales jóvenes parece resultar inadecuada para evaluar sustancias o procedimientos con actividad neuroprotectora, como ha sido sugerido en experimentos donde se ha utilizado la hipotermia en el modelo de isquemia transitoria. Hasta donde alcanzan nuestros resultados, no resulta adecuado diseñar experimentos de este tipo con animales menores de un año de edad. 

Conclusiones
Se encontró una mayor vulnerabilidad en edades adultas, lo cual nos permite proponer que los animales jóvenes no sean utilizados como modelo en evaluaciones de este tipo, donde se persigue reproducir un estado clínico semejante al del ser humano, en la enfermedad cerebrovascular oclusiva.
La vulnerabilidad es mayor en los machos, al menos en el modelo de oclusión unilateral permanente. En el modelo de isquemia bilateral transitoria no existen elementos para excluir el uso de hembras en las evaluaciones de agentes terapéuticos.

Referencias
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2. Hossmann K.A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovascular Research;39:106, 1998.
3. Doppenberg, E.M; Choi, S.C; Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: what can we learn from previous studies? Neuroprotective agents – Third international conference. Annals of the New York Academy of Sciences; 825: 305, 1997.
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5. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR). Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restaurative drug development stroke;30:2752, 1999.
6. Zapater G., Matías Guiu J., Martínez Vila E., Martín Vilalta J.L. Isquemia cerebral global experimental Isquemia cerebral global. Grupo de estudios de las enfermedades cerebrovasculares. Sociedad Española de Neurología:ll-20, l992.
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Fig. 1. Disminución del valor de la pendiente de la curva de habituación en los animales adultos de ambos sexos, una semana después de la oclusión de la carótida derecha. * p = 0.01; ** p = 0.001.


Fig. 2. Porcentaje de animales isquémicos que disminuyen la pendiente de la curva de habituación después de una semana de isquemia unilateral. * p = 0,02; ** p = 0,008.

Fig. 3. Disminución del valor de la pendiente de la curva de habituación en gérbiles de 12 meses en ambos sexos, una semana después de la oclusión bilateral de ambas carótidas durante 5 minutos. 
* p = 0,01; ** p = 0,03.


Fig. 4. Pendiente de la curva de habituación una semana después de la oclusión bilateral de las carótidas durante 5 minutos. * p = 0.01 en la prueba de chi cuadrado.

Tabla 1: Incidencia de alteraciones histopatológicas en gérbiles sometidos a isquemia unilateral permanente. a diferente del sexo opuesto; b diferente del grupo adulto joven correspondiente;
p < 0.05

AUTORES:
Sosa Testé Iliana(1)*, 
García Salman J.D.(2), 
Rodríguez Yamila(3), 
Subirós Nelvys(2), 
Rodríguez Katiuska(1), 
Thomas Albertina(1). 

Centros: 
1- CENPALAB, 
2- INN, 
3- ISCM Girón Grupo GENI
* Tecnólogo de I Nivel, Prof. Titular. Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio Provincia Habana (CENPALAB). Cuba. 6833153 Email: ccalidad@cenpalab.inf.cu.

Enviado por Dra. Iliana Sosa Testé y Otros Autores
Contactar mailto:ccalidad@cenpalab.inf.cu

Código ISPN de la Publicación: EEyFpAVAlpCfBOoWnY
Publicado Thursday 9 de November de 2006