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Normas de Procedimiento en Hemocultivos


Enviado por Lic. Eric Caballero J
Código ISPN de la Publicación: EEykVEukFVHIXXTkhc


Resumen: En consideracion de que el sindrome septico constituye una grave emergencia medica, la prontitud y certeza en el diagnostico etiologico de una septicemia, es una responsabilidad del laboratorio de microbiologia que requiere de la implementacion de normas de procedimiento que puedan ser utilizadas en todas las secciones de microbiologia de los hospitales del pais. (E)


   

  

INDICE
1. Introducción

2. Patogénesis del síndrome séptico
i. Bacteremia relacionada a cateter
ii. Sepsis en pacientes inmunocomprometidos
iii. Endocarditis infecciosa

3. Colección de la muestra
i. Momento de la obtención de la muestra
ii. Toma de muestras
iii. Volumen de las muestras
iv. Número de hemocultivos

4. Recibo de las muestras

5. Factores que afectan el aislamiento de los microorganismos

6. Periodo de incubación
i. Referencias que avalan el periodo de incubación

7. Procedimiento en caso de hemocultivos positivos

8. Reporte de cultivos negativos

9. Sistemas automatizados para la evaluación de los hemocultivos
i. Bactec 9240
ii. BacT/Alert

10. Acción ante resultados inconsistentes

11. Diferenciación entre infección Vs contaminación

12. Interpretación de los resultados
i. Cultivos percutaneos Vs a través del cateter
ii. Cantidad de crecimiento por botella
iii. Doble aguja o una aguja
iiii. Consideraciones generales 

13. Bibliografía de referencia 

1. INTRODUCCION
En consideración de que el síndrome séptico constituye una grave emergencia médica, la prontitud y certeza en el diagnóstico etiológico de una septicemia, es una responsabilidad del laboratorio de microbiología que requiere de la implementación de normas de procedimiento que puedan ser utilizadas en todas las secciones de microbiología de los hospitales del país. 

Cada año, en todo el mundo, se producen alrededor de 18 millones de casos de sepsis grave en el mundo. Este síndrome es causa de una mortalidad cercana al 30% siendo unas 1.400 las personas que mueren cada día por esta enfermedad, por lo que es una de las principales causas de mortalidad en el mundo.

El hemocultivo se describe como una prueba diagnóstica utilizada cuando se sospecha de septicemia. La indicación clásica de obtener hemocultivos, es la sospecha de bacteremia en pacientes con o sin foco aparente de infección. 

La septicemia es una infección grave potencialmente mortal, que progresa rápidamente y que puede surgir de infecciones en otras partes del cuerpo, especialmente infecciones en los pulmones, abdomen y tracto urinario. La septicemia puede conducir rápidamente a un shock séptico, insuficiencia renal y coagulopatía intravascular diseminada.

En los últimos años han ocurrido varios cambios en este tema, tales como el aumento del número de pacientes inmunocomprometidos, la necesidad de aislar microorganismos no habituales y el advenimiento de sistemas automatizados.

Con propósito de actualizar los procedimientos diagnósticos en este campo, hemos preparado esta guía para la evaluación de los hemocultivos. Posee información actualizada de la literatura especializada aplicada a nuestra realidad y complementada con la experiencia adquirida durante los años de trabajo; la información está relacionada con todas las etapas en la investigación del hemocultivo, las técnicas complementarias referentes a métodos rápidos de detección e identificación, consideraciones generales y algunas anotaciones sobre los sistemas automatizados para la evaluación del hemocultivo.

2. PATOGENESIS DEL SINDROME SEPTICO :
El inicio de la septicemia se anuncia con picos febriles, escalofríos, frecuencia cardiaca y respiratoria aceleradas. Estos síntomas avanzan rápidamente hacia un shock, con disminución en la temperatura corporal (hipotermia), descenso de la presión arterial, confusión u otros cambios en el estado mental y anomalías en la coagulación, que se evidencian por lesiones hemorrágicas en la piel (petequia ). 

Síntomas
· Fiebre (inicio súbito, a menudo con picos) 
· Escalofríos 
· Apariencia tóxica (semblante de estar gravemente enfermo) 
· Cambios en el estado mental, mostrándose: 
- irritable 
- letárgico 
- ansioso 
- agitado 
- sin entusiasmo 
- comatoso
· Shock 
- frío 
- pegajoso 
- pálido 
- cianótico (de color azul) 
- sin entusiasmo 
· Signos de piel que se asocian con las anomalías en la coagulación 
- petequias
- equimosis (se manifiesta con frecuencia con lesiones grandes, planas y purpurinas que no palidecen cuando se presionan) 
- gangrena (se presenta con cambios tempranos en la extremidades sugiriendo que hay disminución o ausencia en el flujo sanguínea.

Un examen físico puede mostrar:
· Presión sanguínea baja (hipotensión) 
· Temperatura corporal baja (hipotermia) o fiebre 
· Signos de enfermedades asociadas tales como: meningitis, epiglotitis, neumonía, celulitis u otras. 

Los síntomas clínicos de la sepsis son debidos a los productos tóxicos de las bacterias. El huésped responde a éstos tóxicos o a ambas. El shock es visto mas comúnmente en septicemia por Gramnegativos. La porción lípida A de la endotoxina, la cual está por fuera de la membrana del lipopolisacarido, inicia la cadena de la reacción, incluyendo la producción del factor tumor-necrosis ( TNF ), interleucina-1 ( IL-1 ) y la activación del complemento, lo cual contribuye a la respuesta del shock que se observa en el paciente.

La Bacteremia, la cual es la presencia de bacterias en la sangre, puede ser transitoria, intermitente o continua.

La bacteremia transitoria , es la presencia de bacterias en la sangre por un periodo de pocos minutos solamente. Un ejemplo común es la extracción dental y la cateterización urinaria. La bacteremia transitoria también está asociada con focos de infección localizada como la pneumonía por pneumococos y la pielonefritis.

La bacteremia intermitente
es realmente recurrente y transitoria y característicamente está asociada a drenaje y abscesos intra-abdominales. Esto ocurre el inicio de una variedad de infecciones sistémicas y localizadas. Los cultivos pueden no mostrar la bacteremia, ya que las mismas pueden ser despejadas del torrente por los mecanismos de defensa del huésped.

La bacteremia continua,
sugiere una infección severa que ha traspasado las defensas del huésped. Es característico de infección intravascular como la endocarditis y la tromboflebitis supurativa. En pacientes inmunocomprometidos, la bacteremia continua puede ocurrir de fuente no vascular.

i. Bacteremia Relacionada a Cateter :
Confirmar que el catéter es la fuente de la infección de la bacteremia relacionada a cateter es un tanto difícil. A menudo no hay evidencia en el sitio de la inserción del cateter y los  organismos implicados son con frecuencia parte de la flora normal de la piel y contaminantes comunes de los cultivos de sangre. 

El diagnóstico de la bacteremia relacionada a cateter usualmente consiste en : 
• Aislamiento del mismo organismo de la sangre y del sitio purulento de la inserción del cateter intravenoso o la punta del cateter.
• Sepsis clínica, resistencia a la terapia antimicrobiana, que se resuelve con el retiro del catéter 
• Cultivo cuantitativo diferenciado (diez veces más organismos en sangre obtenida a través del cateter que de una vena periférica). Esto tema es muy conflictivo y será desarrollado mas adelante.
* El tiempo diferente de positividad para el cultivo de sangre a través de la línea y la sangre periferica , incubados en sistemas automatizados, pueden ser útiles en el diagnóstico de bacteremias relacionadas a cateter.

ii. Sepsis en pacientes inmunocomprometidos :
Los pacientes inmunocomprometidos son particularmente propensos a infecciones severas en la sangre, que en muchos casos son la causa de su muerte, debida a infecciones secundarias.

Los defectos en la fagocitos, el complemento, la formación del anticuerpo y la inmunidad mediada por células, se asocian a menudo a un desorden o a una enfermedad particular tal como malignidad, síndrome de inmuneodeficiencia adquirida (SIDA) o anemia falciforme y en los pacientes que han tenido trasplante del órgano, terapia inmunosupresora o esteroides. El riesgo de la infección es más grande en el caso de pacientes con neutropenia.

En los pacientes immunocomprometidos se da una alta incidencia de la infección causada por organismos que son no-virulentos en el huésped normal y que forman parte de su flora normal. Éstos microorganismos serían considerados generalmente como contaminantes en el anfitrión immunocompetente. Ejemplos son los estafilococos coagulasa negativa, enterococos y estreptococos viridans. 

Los pacientes esplénicos son susceptibles a septicemia fulminante causada por una variedad de microorganismos, particularmente bacterias capsuladas tales como S. pneumoniae, H influenzae y N. meningitides, pero también organismos menos comunes tales como la Capnocytophaga sp.

El espectro de los organismos detectados ha cambiado en años recientes. Esto se debe probablemente a la duración de la estancia del hospitalaria y un uso creciente de catéteres venosos centrales ( CVC ) y a los antibióticos del amplio espectro. Las infecciones polimicrobianas son más comunes en este grupo de pacientes. Los aislamientos incluyen :
o Bacilos Gram-negativos no fermentativos
o Listeria monocytogenes
o Corynebacterium sp
o Candida sp y otros hongos
o Mycobacterium sp
o Virus

iii. Endocarditis infecciosa :
La endocarditis infecciosa es la infección de las válvulas del corazón y/o de otras áreas del endocardio. Ocurre generalmente en el sitio de una lesión cardiaca o de un defecto congénito donde hay flujo turbulento de sangre, daño endocardial y adherencia de plaquetas. Un coágulo de fibrina es depositado en la superficie endocardial dañada y se coloniza con los organismos que han entrado en la circulación sanguínea, formando una vegetación infectada. Las bacterias viables pueden estar presentes en lo profundo de la vegetación así como en la superficie, lo que hace el tratamiento antimicrobiano difícil.

La enfermedad es usualmente clasificada como "aguda" o "subaguda" en referencia al curso de la enfermedad no tratada. La endocarditis aguda fue utilizada para describir la colonización de las válvulas normales del corazón por bacterias virulentas, que conducen a la destrucción rápida de la válvula, focos metastáticos extensos, paro cardíaco y muerte rápida. La endocarditis subaguda se refiere a la infección de válvulas anormales por organismos menos virulentos, a menudo siendo un proceso insidioso, con focos metastáticos menos frecuentes. 

3. COLECCION DE LA MUESTRA

i. Momento de la obtención de la muestra. 
Se ha documentado que el mejor momento para obtener la muestra de sangre es entre 2 horas a 30 minutos antes del pico febril, lo cual fue demostrado por el trabajo de Thompson y Evans. Dado que no se puede predecir el momento del pico febril, se recomienda de forma arbitraria obtener tres hemocultivos en 24 horas, tomados cada 30 a 90 minutos. Si se trata de un paciente grave, se recomienda obtener los 2 a 3 hemocultivos dentro de un período corto de tiempo e iniciar precozmente la terapia antimicrobiana.

ii. Toma de muestra :
Se recomienda una limpieza primaria del área a puncionar con Povidona-Iodada ; luego se quita el exceso del iodóforo con alcohol al 70%. A continuación se extraen de 5 a 10 ml de sangre si es un adulto, o de 1 a 5 ml si es un niño, para una dilución de 1:10 con respecto al medio de cultivo . La sangre se vierte en el frasco evitando producir hemólisis; el tapón de caucho debe desinfectarse previamente con yodo al 1-2%, si se trata de frascos convencionales. La muestra se envía inmediatamente al laboratorio de microbiología, debidamente identificada. Esto es particularmente importante para el caso de frascos para sistemas automatizados, en los que la computadora requiere hacer una lectura inicial de los niveles de CO2 en la botella, aunque en ellos también hay un margen de tiempo para la incubación. El promedio de muestras es de 2 por paciente en una hora, en extracciones diferentes. 

Para información adicional sobre la colección de la muestra, recomendamos el Manual de Colección y Transporte de Muestras Microbiológicas del Lic. Eric Caballero y el Dr. Silvio Vega.

iii. Volumen de la muestra :
Se considera que el volumen de sangre cultivado, es el factor más importante para aumentar la sensibilidad de los hemocultivo. Dado que la mayoría de las bacteremias son de baja magnitud (< 1 a 10 ufc/ml), a mayor volumen de muestra obtenido, mayor es la sensibilidad. Se sabe que por cada ml adicional de muestra que se inocule en la botella, aumenta la positividad entre un 2 a 5%. Es por esto que la recomendaciones son obtener el máximo de volumen que la botella sea capaz de tolerar, manteniendo la relación 1:5 a 1:10 entre la muestra y el volumen de medio de cultivo, para contrarrestar la actividad bactericida y celular de las defensas del huésped. Para la gran mayoría de los sistemas automatizados, este volumen de 10 ml para adultos y de 3 a 5 ml para niños.

Algunos autores recomiendan los siguientes volúmenes :
-
Neonatos a 1 año, 0,5 a 1 ml . 
- Entre 1 y 6 años, 1 ml/ año divididos en 2 frascos. 
- Jóvenes, 10 ml. divididos en 2 frascos. 
- Adultos, 20-30 ml. divididos en 2 ó 3 frascos

iiii. Número de hemocultivos 
La recomendación general es 2 a 3 hemocultivos en un período de 24 horas. Se ha demostrado que en un episodio bacteremico la positividad de uno, dos y tres hemocultivos corresponde a 80%, 90% y 99% respectivamente. La obtención de 2 a 3 hemocultivos en 24 horas no sólo aumenta la probabilidad de recuperar las bacterias a partir de la sangre, sino que también puede ser una guía para diferenciar una bacteremia verdadera de una contaminación.

Botellas Bactec Botellas                                    BacT/Alert

4. RECIBO DE LAS MUESTRA
Las muestras deben ser recibidas con el nombre del paciente claramente legible, cédula de identidad personal, procedencia, nombre del médico, número del hemocultivo y hora de la toma de muestra. Estos datos deben coincidir con el formulario enviado. La muestra que no cumpla con alguno de los datos, será devuelta a la sala para completar los mismos. Todo frasco sin nombre debe ser desechado inmediatamente e informar a la sala. Igualmente no se aceptará el recibo de hemocultivo de adulto en frasco pediátrico. En caso de recibirse dos frascos con indicios de haber sido tomados con una misma punción, se anotará la observación en los formularios.

A la muestra se le asignará un número de entrada en un libro especial para hemocultivos; éste número será continuo por el año en curso. En el libro se debe anotar cualquier dato de interés como hora o turno en que se recibe, si se trata de pre o post-exanguíneo transfusión, médula ósea, inmunosuprimido, etc.

5. FACTORES QUE AFECTAN EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS : 
Un número de factores clínicos y técnicos pueden afectar el aislamiento del organismo de infección, sin importar el sistema empleado :

Clínico: 
-Método de colección 
-Número y tiempo de muestreo
-Terapia antimicrobiana anterior 

Técnico: 
-Volumen de la muestra 
-Medios usados 
-Neutralización de agentes antimicrobianos 
-Tiempo y temperatura de incubación 
-Agitación de medios 
-Atmósfera 

6. PERIODO DE INCUBACION
Los frascos rutinariamente se incuban a 35°C inmediatamente a su llegada al laboratorio, hasta por 4 días. En éste aspecto, gracias a la alta sensibilidad de los sistemas computarizados y la optimización de los frascos de cultivo, se ha recomendado disminuir gradualmente el tiempo de incubación. En este aspecto lo más importante es dejar claro que la alta eficiencia de los sistemas automatizados nunca deben ser limitados por la programación que le puedan establecer los operarios según sus consideraciones personales. En la actualidad, la mayoría de los autores recomiendan un periodo de incubación máximo de 72 horas.

i. Referencias que avalan el periodo de incubación requerido :
a) Clinical Infectious Diseases, volume 41 (2005), pages 1677–1680. 
No es necesario extender el tiempo de incubación con organismos fastidiosos como Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium, Eikenella y Kingella (i.e., HACEK)

b) Haimi-Cohen Y, Shafinoori S, Tucci V, et al. Use of incubation time to detection in Bactec 9240 to distinguís coagulase-negative staphylococcal contamination from infection in pediatric blood cultures. J. Pediat. Infect. Dis. 22(11);968-973, November 2003. El tiempo de positividad de ≤15 horas tuvo un valor predecible positivo (VPP) de 84% para diagnóstico de infección, y un tiempo de positividad de 
≥ 22 horas, tuvo un VPP de 87% para el diagnóstico de contaminantes. 

c) Galo P, Rodríguez M, Garrido J , et al. Time to positivity in blood cultures of adults with S. pneumoniae bacteremia. BMC Infectious Diseases, 6:79, April 2006. Usando BacT/Alert entre 1995 y 2004, se estudiaron 105 pacientes con bacteremia por S. pneumoniae. La mediana de detección fue de 14.1 Horas ( Rango de 1.2 h a 127 h ).

d) Lim H, Bint AJ, Fenton A and Moss S. Incubation time for clinical significant positive neonatal blood cultures. Poster. ECCMID, April 2006. Fueron estudiados 229 cultivos positivos en pacientes neonatos y se detectó significativa bacteremia en los que 22 aislamientos (58%) fueron detectados en las primeras 12 horas de incubación, 36 ( 95%) en las primeras 24 horas y la totalidad en 36 horas de incubación. El estudio invita a hacer cambios en los periodos de incubación de los sistemas automatizados.

e) Vilas A, Fontanals D, Sanfelieu I, et. al. Is it necesary to incubate the BacT(Alert blood cultures more than 3 days ?. 16 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. ( ECCMID), Poster. April 2006. Estudio de 94,303 set de botellas de hemocultivos, fueron evaluados por BacT/Alert, de los cuales solo el 10% (9,432 ) tuvo significado clínico. De estos, el 97.9 % ( 9232 ) fueron detectados en los primeros 3 días de incubación. La incubación por más de 3 días, solo representó un 0.3% de aislamientos con significado clínico, por lo que recomiendan reducir el tiempo de incubación a 3 días.

f) Journal of Clinical Microbiology, Vol. 43, No. 5 , Mayo 2005. Un estudio sobre 35,500 botellas de BacT/Alert FA y FN, muestra que el 97.5% de los aislamientos con significado clínico, requirieron 3 días de incubación, por lo que más de ese tiempo parece no ser necesario.

g) Journal of clinical Microbiology, Vol. 39, No6, Junio 2001. Estudio sobre 17,887 set de botellas BacT/Alert , el estudio sugiere que no es necesario mayor tiempo de incubación de 3 días.

h) Revista Argentina de Microbiología. Vol.33, No.3, del 2001. Soloaga, et al. El estudio concluye que los subcultivos terminales a ciega y la incubación prolongada de hemocultivos del sistema BacT/Alert proveniente de paciente inmunocomprometidos, no son necesarios y representan una sobrecarga de trabajo y un gasto innecesario. El 94.5% se hicieron positivos a las 72 h de incubación. El estudio incluyó hongos levaduriformes.

J) Paediatric infectious diseases. Abril 2006.
Sobre el tiempo de detección de microorganismos de importancia neonatal con BacT/Alert , indica que el tiempo promedio de detección fue de 12 horas, y la 
totalidad en las primeras 36 horas.

l) Clin Inf. Dis. 2005. January 1;40(1):2002
Estudio sobre 37,568 botellas con Bactec 9240, escrito por Washington JA, indica que al comparar esta data con los protocolos que él escribió en la década de los 1970 y 80, se hace necesario una revisión de los procedimientos de cultivo de sangre, especialmente el tiempo de incubación, el cual debe ser acortado.

m) Indian Journal of Microbiology. 2005, Vol. 23, No.4, P. 270-271. Un periodo de incubación de 4 días es suficiente para detectar los microorganismos de importancia en sepsis de neonatos. La incubación por más de este tiempo, no justifica el tiempo y costo utilizado.

Los frascos que actualmente se usan para hemocultivos, son capaces de detectar la presencia de hongos en un periodo de tiempo casi tan rápido como las bacterias. Sin embargo, queda a discreción del laboratorio dejar por un tiempo no mayor de 5 días los cultivos específicos por hongos y/o de pacientes inmunocomprometidos. El frasco se descarta luego para su posterior incineración. En el caso de los frascos para la detección de micobacterias, el mismo debe dejarse en incubación el tiempo que recomiende el inserto correspondiente.

7. PROCEDIMIENTO EN CASO DE HEMOCULTIVOS POSITIVOS
Una vez que la alarma del equipo detecte la posibilidad de un hemocultivo positivo, se realiza el frotis por Gram y transplante a Agar sangre y agar chocolate. Si el frotis del frasco de hemocultivo revela la presencia de microorganismos, se hace un informa primero telefónico indicando lo observado y un informe escrito en el que se indica la morfología y reacción al Gram del microorganismo, anotando que se continuará con la identificación etiológica y el antibiograma. El laboratorio enviará el original del informe preliminar a la sala, guardando una copia y entregará la otra al Comité de Infecciones Nosocomiales.

8. REPORTE DE LOS CULTIVOS NEGATIVOS
El formulario de hemocultivo se reporta y envía a la sala como “Negativo en 96h” o “No hubo crecimiento en 96h”, si se cumple ésta condición. 

9. SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA LA EVALUACION DEL HEMOCULTIVO:
Los sistemas automatizados han tomado ventaja del monitoreo continuo y automático de las botellas de hemocultivo, lo cual ha traido un gran impacto en la detección temprana de bacteremias y como un soporte en la cobertura microbiológica las 24 horas del día. Existen en el mercado varios sistemas de evaluación automatizada de los hemocultivos, entre los que sobresalen :
§ Bactec 9240 ( Becton Dickenson Diagnostic)
§ BacT/Alert Microbial detection system ( Organon Teknika Co.)
§ E S P Culture System (Difco Laboratories ).
§ BacT/Alert 3-D ( Organon Teknika )

i. Bactec 9240
Fundamento: Cuando los microorganismos están presentes, metabolizan los nutrientes del medio de cultivo, produciendo CO2. Un tinte en el sensor reacciona con el CO2. Este mide la cantidad de luz que es absorbida por un material fluorescente en el sensor. El fotodetector del instrumento mide el nivel de fluorescencia, lo cual corresponde a la cantidad de CO2 producido. Esta medición es interpretada por el sistema de acuerdo a los parámetros positivos pre-programados.


Sistema Computarizado Bactec 9240

Conceptos de Utilidad:
a) Falso Positivo: Se refiere a las botellas que el instrumento llama positivas, pero que no muestran microorganismos en el frotis ni en el subcultivo.
b) Falso Negativo: Ocurre cuando el instrumento no detecta crecimiento, pero el organismo crece en el subcultivo.


BOTELLAS DE HEMOCULTIVOS DEL BACTEC 9240

ii. BacT/Alert

Fundamento:
El sistema utiliza un sensor colorimétrico y una luz reflejada para monitorear la presencia y producción de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Si existen microorganismos en la muestra, se genera CO2 producto de que los microorganismos metabolizan los substratos del medio de cultivo. Debido a esto, el sensor gas-permeable instalado en el fondo de cada frasco de cultivo cambia de verde a amarillo, indicando que está positivo. Esta positividad es captada por el sensor del instrumento, que activa una alarma y se enciende una luz en la celda del frasco respectivo.

iii. Consideraciones Técnicas :
1. Un estudio en base a 11,476 botellas subcultivadas después que el BacT/Alert las reportó negativas en 5 y 7 días dio como resultado solo un 0.2% de positividad, lo que hace el subcultivo rutinario innecesario.(Ref. J.Clin.Microbiol.1992. Vol.30,N°10).

2. Un extenso estudio utilizando botellas aeróbicas y anaeróbicas a la vez, demostró una adecuada recuperación de microorganismos aeróbicos estrictos en el frasco anaeróbico, inclusive Pseudomonas sp, Stenotrophomona ( Xanthomona maltophilia ) y Candida sp, lo cual indica que se pueden utilizar éstos últimos para aeróbicos, si es necesario. El frasco anaeróbico solo falla en aislar el Campylobacter jejuni.( Ref. J.Clin.Microbiol.1995, Vol.33, N°5 ).

3. Gran parte de los falsos positivos se deben al sobrellenado de las botellas cuando son extraídas dos botellas a la vez, con la misma punción. En éstos casos la primera botella casi siempre tiene más sangre de lo recomendado.

4. Porcentaje de falsos positivos encontrados con el sistema BacT/Alert : 1.2 a 1.8%.Porcentaje de falsos negativos encontrados con el sistema BacT/Alert : 0.4% 
( Ref. J.Clin.Microbiol.1995, Vol.33,N°5 ).

5. La botella aeróbica FAN que contiene infusión de cerebro corazón y partículas de carbón, es superior a la botella estándar para el aislamiento de microorganismos fastidiosos, bacterias y hongos y útil en pacientes que reciben antibióticos. Teniendo el único inconveniente en la lectura del frotis cuando hay cocos grampositivos, los cuales se pueden confundir sobre el fondo de partículas de carbón. Su rata de falsos positivos fue de 0.6% ( Ref.J.Clin.Microbiol.1995. Vol.33,N°4 ).

6. La presencia de antibióticos en la sangre, puede provocar que los microorganismos no produzcan suficiente CO2 detectable por el instrumento.

7. Algunas cepas de H. influenzae, N.meningitidis, N.gonorrhoeae y P. anaerobius, pueden ser sensibles al anticoagulante SPS, por lo que puede resultar en falta de crecimiento o baja producción de CO2 no detectada por el instrumento.

8. Al igual que el sistema Bactec, una cantidad elevada de leucocitos en la sangre, puede ser causa de falsos positivos.

9. Hay que retirar los frascos positivos inmediatamente lo indique el aparato, para evitar la autólisis del microorganismo. S. pneumoniae es un ejemplo de bacteria que hace autólisis.

10. Los frascos irrompibles eliminan los costos y la pérdida de tiempo asociados a la limpieza por derrames.

11. Los frascos BacT/ALERT FA eliminan la necesidad de un frasco destinado al cultivo de hongos en cultivos de rutina.

12. Se sugiere que el uso rutinario de frascos de cultivo anaeróbicos raramente resulta en un diagnóstico de importancia clínica o de beneficio terapéutico. Estos frascos solo deben ser utilizados cuando el paciente muestra un riesgo real de infección por anaerobios. Am J Med. 2000 Apr 15;108(6):445-7. Routine use of anaerobic blood cultures: are they still indicated?

13. Un artículo sobre el efecto de la demora en la entrada de los hemocultivos a su incubación, con los sistemas BacT/Alert y Bactec, concuerdan en que la demora en botellas mantenidas a 4◦ C ó a temperatura ambiente hasta por 24 horas, no afecta la sensibilidad del sistema. Journal of Clinical Microbiology, April 2006, p. 1245-1249, Vol.44, No.4

14. La colección de sangre a través de cateter venoso central (CVC) para el diagnóstico de bacteremia, es un sistema muy sensible, específico y con alto valor predictivo, especialmente si se hace cultivo cuantitativo utilizando un punto de corte de 15 UFC/ml. Journal of Clinical Microbiology, May 2006, p. 1834-1835, Vol. 44, No. 5.

10. ACCIÓN ANTE RESULTADOS INCONSISTENTES :
En ocasiones pueden observarse condiciones confusas e inconsistentes en los que el técnico debe evaluar las circunstancias para la toma de decisiones. Éstos incluyen las botellas con: 

Apariencia Positiva / Alarma positiva, frotis por Gram positivo y subcultivo negativo :
Esto ha sido visto con S. pneumoniae que han experimentado algún grado de autólisis, y en organismos fastidiosos que no pueden crecer en medios de cultivo sólidos. Medios adicionales o suplementos, incubación prolongada o necesidad de crecimiento en atmósfera especial, se debe considerar, dependiendo de la microscopia y las indicaciones clínicas. Algunos medios han reportado reducir la autólisis de los S. pneumoniae. Si se sospecha la presencia de pneumococos por microscopia o clínica, puede ser útil inocular algo de la mezcla del lisado del hemocultivo, a una botella de hemocultivo nueva en una tentativa de recuperar organismos viables o se puede considerar la utilización de pruebas de antígeno directo, por un método validado en botellas de hemocultivo. 

Apariencia positiva/Alarma positiva, con frotis por Gram y subcultivo negativo :
Es importante examinar la curva del crecimiento en el sistema automatizado para excluir la posibilidad de un cultivo falso negativo, antes de asumir que es una alarma falso-positiva. 

Las razones de la falsa positividad son a menudo multifactorial. En sistemas automatizados pueden incluir problemas con el equipo, sistema de valores de umbral demasiado bajo, volumen de sangre excedido al recomendado o sangre con altas cuentas del leucocito. En sistemas convencionales, la turbiedad se puede relacionar con aspecto del suero del paciente, más bien que con crecimiento microbiano. Sin embargo, si las curvas del crecimiento indican la posibilidad de crecimiento microbiano, entonces una tinción de carbol- fuchsin o Giemsa puede ser requerido para demostrar la presencia y la morfología físicas. Esto puede dar la dirección para la selección de los medios de subcultivos apropiados.

Apariencia negativa / alarma negativa, con frotis Gram positivo y subcultivo positivo :

Los organismos pueden estar presentes en la botella , pero mostrar mínimo o no criterio de crecimiento. La investigación se basa generalmente en un alto grado de suspicacia clínica. 
Éste puede ser el caso de Brucella , Francisella o Legionella sp.

Botellas de BacT/Alert Positiva y Negativa

11. DIFERENCIACIÓN ENTRE INFECCIÓN VERSUS CONTAMINACIÓN :
Uno de los mayores problemas en la evaluación de la infección sanguínea, es la interpretación del resultado, tomando en cuenta la posibilidad de contaminación de los hemocultivos con microorganismos propios de la piel del paciente, especialmente estafilococos coagulasa negativos.

Se acepta un porcentaje de contaminación que varía entre 2 a 3%, el cual representa costos muy altos para las instituciones y los pacientes. Esta contaminación se atribuye principalmente a problemas durante la toma de la muestra, ya que con los sistemas de hemocultivos automatizados, la probabilidad que se contaminen en el laboratorio es remota. En la actualidad, la tasa de contaminación de los hemocultivos constituye un indicador de calidad en la toma de muestra,

Se han propuesto algunas recomendaciones que permiten predecir una bacteremia verdadera, sin embargo la interpretación de un hemocultivo positivo depende en última instancia de la presentación clínica y del curso de la enfermedad en un paciente determinado. Cuando el microorganismo aislado corresponde a flora de la piel, es necesario diferenciar si se trata de una bacteremia verdadera o de una contaminación. Se ha establecido que en el caso de los Estafilococos coagulasa negativos aislados de un sólo hemocultivo, un 94% corresponden a probable contaminación.. Lo mismo ocurre con el 94% de los Bacillus sp, 99% de los Propionibacteriun acnes, 79% de los Corynebacterium sp y 48% de los Streptococcus viridans. Estos microorganismos pueden ser considerados probables patógenos cuando se aislan en hemocultivos múltiples, cuando corresponde a pacientes inmunosuprimidos o a pacientes portadores de dispositivos protésicos, como catéteres venosos centrales, prótesis ortopédicas, prótesis vasculares o válvulas de derivación ventrículo-peritoneal. 

Un trabajo aparecido en el Pediatric Infectious Disease Journal. 22(11):968-973, Noviembre 2003, sugiere que el tiempo de detección en la incubadora del sistema Bactec 9240, puede separar la posibilidad de infección de una contaminación con Estafilococos coagulasa negativa. Asi por ejemplo, la mediana de detección fue de 11 horas. Un tiempo de detección de positividad de ≤ 15 horas tuvo un valor predictivo positivo de 84% para diagnóstico de infección y uno de ≥ 22 horas tuvo un valor predictivo de 87% para diagnóstico de contaminación.

12. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS :
Aún con los mejores sistemas para hemocultivos, no siempre se obtienen cultivos positivos de los pacientes que cumplen con los criterios clínicos de alta probabilidad de bacteremia. Ello significa que en un importante porcentaje de estos casos de bacteremia clínica no es posible identificar el agente causal, lo que puede deberse a la presencia de bacteremias transitoriaso intermitentes, al uso de antimicrobianos antes de obtener los hemocultivos o a la presencia de agentes infecciosos de difícil aislamiento.

Por otro lado, la presencia de un hemocultivo positivo debe interpretarse a la luz del cuadro clínico, el agente aislado y el número de cultivos positivos, para así decidir cuan significativo puede ser un resultado determinado. Cuando se aislan agentes como S.aureus, enterobacterias, S.pneumoniae , micobacterias u hongos levaduriformes , la probabilidad de representar una infección verdadera es mayor al 90%. En cambio, agentes tales como Corynebacterium sp.,Bacillus spp. o Propionibacterium acnes no constituyen una bacteremia verdadera en la gran mayoría de los casos.

En bacteremias por más de un agente, debemos utilizar para cada microorganismo aislado los mismos criterios antes mencionados, para así decidir si constituyen o no verdaderos patógenos. En situaciones tales como abscesos intraabdominales, infecciones de catéteres, neutropénicos febriles con mucositis intensa o grandes quemados, es frecuente aislar más de un agente infeccioso en hemocultivos; sin embargo, en la gran mayoría de las situaciones clínicas, las bacteremias o fungemias son debidas a un solo microorganismo.

i. Cultivos percutaneos Vs a través de catéter vascular :
Una de las áreas más conflictivas en microbiología es la sepsis relacionada a cateter y el papel del microbiólogo en su diagnóstico. Posiblemente el método más usado en la determinación de cuando el cateter ha sido colonizado o contaminado por microorganismos, es la técnica semicuantitativa de Maki, que establece un punto de corte de 15 ó más UFC/ml como evidencia de colonización.

Cuando los cultivos de sangre obtenidos a través de un cateter vascular son positivos, los resultados podrían indicar una de tres posibilidades: Bacteremia, colonización del catéter, o contaminación del cultivo. La colonización del catéter puede o no progresar hasta causar síntomas de infección o de bacteremia verdadera. Los estudios han demostrado que de 15 a 25% de catéteres venosos centrales son colonizados rápidamente, generalmente por los estafilococos coagulase-negativa, sin que los pacientes tengan alguna evidencia de infección .

Debido a las incertidumbres que rodeaban los cultivos de sangre obtenidos de los catéteres vasculares, la utilidad clínica de estos cultivos ha sido evaluada. En un amplio estudio realizado por un equipo de infectólogos, los cultivos de sangre obtenidos a través del cateter, tenían una sensibilidad del 89%, comparada con el 78% para los cultivos periféricos, con un valor predictivo positivo de 63% para los cultivos a través del cateter, contra el 73% para las cultivos percutaneos . Los resultados de ese estudio eran similares a los de otros, conduciendo a sugerir que si los cultivos se obtienen de un catéter, por lo menos un set de hemocultivos debe ser tomado percutaneamente.

Se ha determinado que los cultivos obtenidos de los catéteres vasculares pueden ser difíciles de interpretar; sin embargo, esta técnica sigue siendo una práctica muy común por muchas razones. En algunos casos el clínico no quiere infligir más dolor al paciente con otra punción percutanea, o tratan de disminuir la probabilidad de inducir bacteremia transitoria al paciente con la flebotomía, especialmente en inmunocomprometidos, pero lo que si es cierto es que en pacientes neonatos el acceso venoso es un gran problema, que en recién nacidos de bajo peso puede causar disminución del volumen sanguíneo producto de muchas extracciones o profundizar la anemia de estos pacientes. 

Algunos estudios han demostrado que los cultivos que se convierten en positivos en más de 3 a 5 días, con mayor probabilidad representan una contaminación.
Lo cierto es que a pesar de las buenas intenciones del uso de los hemocultivos a través del cateter, éstos pueden provocar que se tenga que ordenar más cultivos para comprobar, más estudios diagnósticos, el uso innecesario de antibióticos con la potencial asociación de reacciones alérgicas, interacción de drogas o eventos adversos, etc. 

El Cumitech Blood Culture III de la A.S.M reconociendo la complejidad y lo conflictivo del tema , se permite hacer las siguientes recomendaciones :
-En lo posible, los hemocultivos no deben ser tomados a través del cateter, a menos que el cultivo sea tomado especialmente para evaluar la sospecha de un de un episodio de sepsis relacionada a cateter.
-Cuando se sospecha sepsis relacionada al cateter, el cultivo de sangre periférica debe ser drenado a través de una punción venosa independiente, para documentar bacteremia o fungemia.
-Si el método semicuantitativo de Maki es utilizado con éste objetivo, la sensibilidad del punto de corte debe ser considerado como 5 ó más UFC/Ml como evidencia de colonización.

En última instancia, la contaminación de los cultivos de sangre es un problema complejo y desafiante, que requiere una respuesta multidisciplinaria. 

ii. Cantidad de crecimiento por botella 
Otro método que se ha evaluado para determinar el significado clínico de los resultados de los hemocultivos es la cantidad de crecimiento en el cultivo. Este método ha sido utilizado para distinguir la colonización del esputo, de una pneumonía; la colonización de la orina, de una infección del tracto urinario; una infección sanguínea relacionada a cateter, de una bacteremia clásica.

Sin embargo en la actualidad los datos existentes son muy limitados para apoyar el uso de esta metodología para distinguir cultivos de sangre contaminados de los verdaderamente positivos en adultos. La mayoría de los autores consideran que el cultivo cuantitativo en 
conjunto con la información clínica específica, puede distinguir sepsis de contaminación con los Estafilococos coagulase-negativa en infantes jóvenes, pero advierten que los conteos bajos de colonias no se deben tomar como evidencia de contaminación en poblaciones de alto riesgo. 

iii. Doble aguja o una aguja :
El efecto de la técnica de la doble-aguja en la extracción y llenado de la botella de hemocultivo, contra la técnica tradicional de una sola aguja, con el objeto de disminuir la rata de contaminación, ha sido evaluado por diversos estudios controlados. Los meta-análisis realizados sobre el tema concluyen que la técnica de la doble aguja produce en efecto una disminución de la rata de contaminación entre 2.0 a 3.7% (P < 0.001) .

iiii. Consideraciones generales :
1. No existe diferencias importantes en cuanto a la ventaja que tenga el tipo de medio en el frasco comercial sobre otro, pero sí en los suplementos. Los medios recomendados son el infusión de cerebro corazón, caldo de trypticasa y soya y Columbia. 

2. En el caso de que se sospeche sepsis generalizada por H. capsulatum, tomando en cuenta que vivimos en un país endémico, se recomienda utilizar el sistema ISOLATOR de lísis-centrifugación, de Du Pont, para ayudar a recuperar el microorganismo intracelular, cultivando luego la muestra en Sabouraud-dextrosa agar hasta por un mes.

3. Los microorganismos más relacionados a septicemia guardan relación con el tipo de hospital: Geriátrico, pediátrico, general, oncológico, etc.

4. Los microorganismos asociados a septicemia están relacionados a su vez con la infección primaria; las infecciones del tracto genitourinario producen el 25% de las septicemia, el tracto respiratorio el 20%, los abscesos el 10% y las heridas quirúrgicas el 5% .

5. Las infecciones localizadas provocan bacteremia en forma variable: Hay septicemia en el 50-80% de las meningitis; en el 5-30% de las neumonías; en el 20-70% de las artritis piógenas y en el 30-50% de los pacientes con osteomielitis .

6. Los estudios han revelado que el volumen de sangre es importante en la recuperación de los microorganismos. Un aumento de 2 a 50 ml de sangre, produce un incremento en los cultivos positivos de 30 - 50% .

7. Si un frotis muestra bacilos Grampositivos finos, es necesario realizar inmediatamente un frotis por Ziehl-Neelsen para descartar la posibilidad de Mycobacteremia, la cual no crecerá en agar sangre en menos de 96h de incubación.

8. En aquellos pacientes con enfermedades que afectan el bazo, como la anemia falciforme,debe tener presente la posibilidad de microorganismos encapsulados como N. meningitidis, H. influenzae y S. typhi.

9. En todo momento hay que tener presente que puede haber otros patógenos en el hemocultivo, no detectable por métodos rutinarios, inclusive los virus de la Hepatitis B y de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), por lo que deben seguirse las precauciones universales en el manejo de cualquier hemocultivo.

10. Se deben observar los frascos antes de enviar a la sala, por indicios de contaminación o deterioro, tales como: Turbidez, tapón hinchado o hundido, decoloración, oscurecimiento, etc. En éstos casos no se deben utilizar. Esterilizar en autoclave.

11. En caso de que se haya demora en el envío de los frascos desde la sala y se observen evidencias macroscópicas de crecimiento ( Observar el fondo del tubo por cambio de color) , el frasco no debe colocarse en el instrumento, sino proseguir con el frotis y subcultivo.

12. Una posible causa de falsos positivos, puede ser debido a un recuento alto de leucocitos.

13. Los aislamientos de Salmonella aislados de sitios estériles con MIC a la Ciprofloxacina
de ≥ a 0.125 µg/ml ó resistentes al Acido Nalidíxico, deben ser considerados con reducida sensibilidad a la Fluoroquinolona, y el médico debe ser notificado de fallas clínicas o demora en la respuesta en el tratamiento de la infección.

14. En bacteremias no reportar la sensibilidad a las Cefalosporinas, Penicilinas o inhibidores de betalactamasa (BLEE) debido al “efecto inóculo”.

15. Los resultados obtenidos de hemocultivos post-morten han sido reportados como de usodiagnóstico, si son tomados bajo condiciones controladas, particularmente si el mismo microorganismo es aislado en hemocultivos ante-morten; sin embargo, estos estudios deben ser interpretados con cautela.

16. Los métodos rápidos de identificación a partir del caldo de cultivo en las botellas de hemocultivos, no han sido estandarizados, mostrando gran variabilidad en sensibilidad y especificidad, por lo que su uso debe ser visto con cautela, a menos que el método haya sido validado para éste uso. El test de antígenos, particularmente en S. peumoniae a partir del caldo, podría ser utilizado para confirmar un cultivo, especialmente si se sospecha de autólisis del microorganismo.

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LABORATORIO CLINICO
COMPLEJO HOSPITALARIO Dr.A.A.MADRID,C.S.S
REPUBLICA DE PANAMA

AUTOR:
Lic. Eric Caballero J
Noviembre ´2006
ecaballe@cwpanama.net
Laboratorio Clínico, 
C.H.M, Dr. A.A.Madrid , C.S.S

Revisión: Noviembre de 2006


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Publicado Thursday 2 de November de 2006