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Diagnostico de la Toxoplasmosis


Enviado por Jorge Fraga y Yenisey Alfonso
Código ISPN de la Publicación: EEyykppVyAtCDwXxjV


Resumen: La toxoplasmosis es una zoonosis parasitaria, provocada por el protozoario Toxoplasma gondii que afecta al hombre y a diversas especies de mamiferos y aves. En el ser humano la enfermedad puede presentarse en forma aguda o cronica, sintomatica o asintomatica, congenita o adquirida, y presentarse tanto en sujetos inmunocompetentes como inmunodeprimidos.


   

  

Índice
Resumen.
Introducción.
Pruebas para el diagnóstico de la infección.
1. Técnicas para detectar anticuerpos
1.1 Prueba del azul de metileno.
1.2 Prueba de Látex.
1.3 Prueba de Hemaglutinación Indirecta.
1.4 Reacción de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).
1.5 Ensayo Inmunoenzimático en fase sólida (ELISA).
2. Técnicas para detectar el parásito, sus antígenos o su ADN.
2.1 Visualización.
2.2 Aislamiento del parásito.
2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).
Selección de pruebas en grupos clínicos de pacientes. 
Pacientes inmunocompetentes.
Pacientes con toxoplasmosis ocular.
Gestantes y perinatal.
Diagnóstico de la gestante.
Diagnóstico prenatal.
Diagnóstico post-natal. 
Pacientes inmunodeprimidos.
Referencias bibliográficas.

Resumen
La toxoplasmosis es una zoonosis parasitaria, provocada por el protozoario Toxoplasma gondii que afecta al hombre y a diversas especies de mamíferos y aves. En el ser humano la enfermedad puede presentarse en forma aguda o crónica, sintomática o asintomática, congénita o adquirida, y presentarse tanto en sujetos inmunocompetentes como inmunodeprimidos. El diagnóstico de la toxoplasmosis ha sido llevado a cabo a través de diversos métodos. Estos incluyen la utilización de técnicas serológicas, histológicas, biológicas y moleculares, debiendo usarse en forma combinada en la práctica clínica. Nos propusimos en esta monografía ofrecer un resumen de las pruebas de laboratorio más importantes que se han usado para el diagnóstico de la toxoplasmosis, así como las técnicas más adecuadas a emplear para cada grupo clínico en particular, con el fin de establecer un diagnóstico correcto. 

Introducción.
La toxoplasmosis es la enfermedad clínica o patológica causada por la infección con Toxoplasma gondii, parásito intracelular obligado de una amplia distribución mundial, que esta presente en todos los climas y en todas las agrupaciones de animales de sangre caliente (Tenter et al, 2000; Remington et al, 2001). En la población humana se encuentra distribuido ampliamente y se estima que afecta a más de un billón de individuos en todo el mundo (Dubey et al, 1998).

El reservorio principal lo constituyen los animales de compañía, aunque es principalmente el gato el animal intermediario ya que es capaz de soportar el ciclo sexuado del parásito, constituyendo de esta forma su hospedero definitivo (Frendkel et al, 1970; Dubey y Beattie, 1988).

La infección ocurre generalmente en edades tempranas de la vida adquiriéndose principalmente por dos vías, la oral al ingerir agua y/o alimentos contaminados con las heces de los felinos infectados, consumo de carne sin cocinar o mal elaborada y la congénita cuando la madre le transmite la infección al feto durante el embarazo (Isaax-Renton et al, 1998; Cole et al, 2000; Cook et al, 2000; Tenter et al, 2000; Bahia-Oliveira et al, 2003).

La forma más común de infección es la inaparente siendo más rara la enfermedad sintomática. El establecimiento de una u otra forma depende de varios factores como son: la cepa infectante, la dosis de inoculación, vía de infección y respuesta inmune del huésped (Ginorio, 2001). 

La severidad de la infección con T. gondii depende de la inmunocompetencia del paciente. En las personas con un sistema inmune competente la infección es generalmente asintomática por lo que el diagnóstico en estos casos solo puede hacerse por pruebas de laboratorio, mientras que en los individuos con inmunodeficiencia severa como los enfermos con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) la infección tiene un comportamiento frecuentemente mortal. 

En la actualidad el estudio de la toxoplasmosis se divide en cuatro categorías clínicas.
· Toxoplasmosis aguda adquirida en el paciente inmunocompetente.
· Toxoplasmosis ocular.
· Toxoplasmosis congénita.
· Toxoplasmosis aguda adquirida en el paciente inmunodeficiente.

El diagnóstico de la toxoplasmosis humana se realiza mediante métodos biológicos, serológicos, histológicos o moleculares, o con la combinación de estos (Hill y Dubey, 2002). A continuación se describirá el fundamento de algunas de las técnicas más utilizadas.

PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCIÓN
1. Técnicas para detectar anticuerpos.
Las técnicas para demostrar anticuerpos específicos contra T. gondii son métodos iniciales y prioritarios para el diagnóstico de la Toxoplasmosis. Fundamentalmente se basan en las determinaciones de anticuerpos en suero, pero se han utilizado otros fluidos biológicos como Líquido cefalorraquídeo (LCR), Líquido amniótico, saliva y orina y detectándose inmunoglobulinas A, M, G, E cada uno con su significado diagnóstico. Las diferentes inmunoglobulinas son consideradas como marcadores de la fase aguda o crónica de la infección como se explica a continuación (Fillisetti y Candolfi, 2004).

IgM: Es el primer anticuerpo en aparecer. Clásicamente fue considerado como un marcador de la fase aguda de la enfermedad sin embargo en la actualidad se conoce que los títulos de IgM pueden permanecer detectables durante muchos meses e incluso años después de producida la infección primaria.

El principal valor de la IgM es que su ausencia prácticamente descarta la infección reciente aunque hay que tener en cuenta que en el caso de los neonatos la respuesta de anticuerpos IgM puede demorar varios meses después de la infección. La presencia de IgM por el contrario implica la necesidad de proseguir el estudio porque la simple detección de este anticuerpo es difícil de evaluar si no se tienen datos de los títulos de IgG e IgM en muestras seriadas o con los resultados de otros ensayos (IgA e IgE) que sugieran una infección reciente.

IgG:
Esta inmunoglobulina es la segunda en aparecer. La presencia de anticuerpos IgG implica que en algún momento de la vida el paciente ha estado en contacto con el parásito y solo es posible asegurar que existe una infección reciente si entre dos muestras separadas 3-4 semanas existe una seroconversión del titulo de IgG.

IgA: Ha sido observada en dos formas en respuesta a la infección con Toxoplasma: la mucosal en las secreciones mucosales y la IgA presente en el suero. Algunos estudios han indicado la importancia de la IgA como un elemento de la inmunidad de mucosas a la infección oral con quistes de Toxoplasma (Chardes et al, 1990). Es considerada también como un marcador de la fase aguda, se ha comprobado que, si bien al igual que la IgM puede permanecer positivo varios meses después de la primoinfección, el porcentaje de IgA residual es mucho menor que el de IgM. En el adulto la cinética de la producción de IgA específica es prácticamente paralela a la de IgM, aunque aparece un poco más tarde y desaparece más precozmente.

IgE: La detección de este anticuerpo aún se mantiene poco estudiada aunque parece ser prometedora como marcador de infección adquirida recientemente. Datos limitados sugieren que la presencia de IgE en un paciente con infección aguda es breve en el tiempo más aun que los niveles de IgM e IgA (Villena et al, 1999; Fillisetti y Candolfi, 2004).

Diferentes técnicas se han usado para detectar la presencia de anticuerpos en los diferentes fluidos, las principales se describen a continuación:
1.1. Prueba del azul de metileno (Prueba de Sabin y Feldman o Dye Test) (Sabin y Feldman, 1948).

Mide preferentemente anticuerpos de tipo IgG, es una prueba serológica altamente específica y sensible, pero cuyas dificultades técnicas y su peligro al usar parásitos vivos, limitan su empleo a un reducido número de laboratorios especializados (Dubey, 1994). Necesita además un factor accesorio (complemento sérico humano), proveniente de personas sanas.

Como antígenos se utilizan Toxoplasmas vivos, ya que estos pierden la capacidad de colorearse con azul de metileno al ponerse en contacto con sueros que contienen anticuerpos debidos a Toxoplasma, pudiéndose observar al microscopio corriente o con contraste de fase. Los parásitos alterados por la acción de los anticuerpos, no toman el colorante. Si el 50% o más se encuentran sin teñir la reacción es positiva. Se informa como título la última dilución del suero en la cual se encuentra la reacción positiva. Es un método de alta especificidad pues no hay reacción cruzada con otros protozoos o agentes infecciosos (Rey, 1991; Botero y Restrepo, 1992; Aguilar, 1997; Beaman et al, 1997).

1.2. Prueba de Latex.
Es una prueba práctica, sensible, fácil de realizar, de bajo costo, útil sobre todo en los tamizajes y detecta anticuerpos del tipo IgG. La reacción se práctica en sueros previamente tratados con el 2-mercaptoetanol que destruye tantos la macroglobulinas inespecíficas como los anticuerpos IgM. El suero se estudia en placa de microtitulación sobre dos diluciones diferentes o más según el se trate de un tamizaje o de una titulación. Una reacción negativa se traduce en la formación de un botón de sedimentación redondo, de bordes netos y. Las reacciones positivas muestran una sedimentación en forma de velo.

1.3. Prueba de Hemaglutinación Indirecta.
Esta prueba se fundamenta en la propiedad que tienen los anticuerpos anti-T. gondii de producir aglutinación en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con antígenos citoplasmáticos y de membrana del parásito. El empleo de ambos tipos de antígenos incrementa la sensibilidad del método permitiendo la detección precoz de la infección. Tanto la presencia de antígenos heterófilos como la aparición de IgM, característica del período agudo de la parasitosis, se investigan empleando tratamiento con 2-mercaptoetanol y eritrocitos no sensibilizados para el control y absorción de la heterofilia (Patton et al, 1990).

1.4. Reacción de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).
Es una técnica específica, reproducible, simple, rápida y de fácil disponibilidad. Proporciona resultados en todas las fases de infección, pudiendo detectar anticuerpos específicos contra Toxoplasma de tipo IgG, IgM o IgA. Se prefiere por su fácil ejecución, no requiere del trabajo con parásitos vivos, ni con factor accesorio que es difícil de conseguir. Se utilizan Toxoplasmas muertos por formol o liofilizados. La inmunoglobulina presente en el fluido biológico del paciente se adhiere a la pared del parásito, donde se ponen de manifiesto por medio de anti-inmunoglobulina humanas conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Necesita de un microscopio de luz fluorescencia. La lectura se facilita por una tinción con azul de Evans. Los títulos son tan altos como los de la prueba de Sabin Feldman. Es una prueba sensible y especifica pero puede dar algunas reacciones cruzadas (Rey, 1991; Botero y Restrepo, 1992; Aguilar, 1997).

1.5. Ensayo Inmunoenzimático en fase sólida (ELISA).
Para la ejecución de las técnicas de ELISA normalmente se utilizan placas de poliestireno o cloruro de polivinilo, de fondo plano y 96 pocillos. El tapizado o recubrimiento de la fase sólida debe realizarse con una concentración adecuada del antígeno o el anticuerpo previamente seleccionado. Las enzimas más utilizadas para el marcado de antígenos o más frecuentemente de anticuerpos, son la fosfatasa alcalina (PA) de mucosa intestinal de ternera y la peroxidasa (PO) de rábano picante. El objetivo de la conjugación es unir la enzima con el anticuerpo o el antígeno de tal forma que cada uno retenga la cantidad máxima de su reactividad. Los sustratos o cromógenos acoplados deben ser solubles en agua, incoloros, poseer una alta constante de enlace con la enzima, y no estar presentes en la muestra a analizar (Porstman y Kiessing, 1992).

El tiempo óptimo de incubación es aquel en el que se obtiene la mayor diferencia de color entre muestras positivas y negativas. Al cabo de este tiempo la reacción puede ser frenada y deben esperarse unos minutos para que se estabilice la coloración antes de proceder a la lectura, donde se consideran positivas todas las muestras que tengan un valor de absorbancia por encima del nivel umbral. Este valor es predeterminado ensayando un gran número de muestras negativas y suele calcularse como la absorbancia media de las muestras negativas más dos o tres veces la desviación estándar.

En el caso de la toxoplasmosis han sido utilizados ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos de tipo IgA, IgM (Fuentes et al, 1996; Borges et al, 2004), IgE (Villena et al 1999; Borges et al, 2004) e IgG (Villard et al, 2003; Borges et al, 2004) en diferentes fluidos biológicos y se han utilizado diferentes principios técnicos para la detección de anticuerpos: la inmunocompetencia, el método indirecto o sandwich indirecto y la inmunocaptura. 

Se ha utilizado además para determinar la avidez de la IgG, ayudando de esta manera a la discriminación entre una infección pasada y una recientemente adquirida. (Fuentes et al, 1996; Remington et al, 2004), brindando gran utilidad en gestantes, en las que no es posible esclarecer una infección adquirida durante la gestación. 

2. Técnicas para detectar el parásito, sus antígenos o su ADN.
2.1. Visualización
Aunque la observación directa del parásito es lo ideal solo es posible hacerlo en un reducido número de casos. El taquizoito puede encontrarse en LCR, ganglios linfáticos, médula ósea y ocasionalmente en otros tejidos. Cuando se obtiene material por punción, se busca el parásito en fresco o coloreado. En los tejidos las características morfológicas son difíciles de precisar, pues el estudio histológico muestra formas redondeadas o partes del parásito, según sea su posición y se requiere mucho tiempo y cortes seriados para poder identificarlo; por ese motivo ocurren errores de diagnóstico a favor o en contra del parásito. Se confunden sus estructuras con otros protozoos y hongos. En los ganglios se parecen a las células reticulares con inclusiones. Los quistes son de reconocimiento mas difícil, se requiere diferenciarlo del pseudoquiste de Trypanosoma cruzi, nidos de Leishmania spp., quistes de Sarcocystis y acumulo de hongos del género Candida e Histoplasma. La coloración con Giemsa o hematoxilina-eosina, ayuda a la diferenciación de los cortes histológicos, así como la Inmunofluorescencia Directa (ID), método más específico, pero también sujeto a errores (Rey, 1991; Botero y Restrepo, 1992; Beaman et al, 1997).

Este método se sigue empleando para estudios en LCR o líquido amniótico. La muestra se centrifuga a 300 xg y el sedimento es observado con 400 aumentos (10x40). Solo la visión de algunos taquizoítos confirmara el diagnóstico.

2.2. Aislamiento del parásito
El aislamiento de Toxoplasma de sangre u otros fluidos biológicos permite establecer el diagnóstico de infección aguda y puede realizarse por inoculación en ratones de laboratorio (Desmonts et al, 1985) o el cultivo celular en fibroblastos humanos (Hofflin y Remington, 1985; Derouin y Garin, 1992). El inconveniente del primero radica en que es un método que consume mucho tiempo para obtener los resultados (3 a 6 semanas) y en el segundo caso a parte del tiempo (4 a 15 días) son muy frecuentes las contaminaciones (Montoya et al, 1996; Priya et al, 2002).

2.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).
La RCP es un método “in vitro” que permite la amplificación selectiva de secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante síntesis enzimática. Fue creada por Kary Mullis en 1983 y desde entonces ha sido ampliamente utilizada en investigaciones de Biología Molecular. 

La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por las ADN polimerasas. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores o cebadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se desea amplificar.

Partiendo de este principio, la RCP se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena
2ª Hibridación de los cebadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras del ADN molde.
3ª Extensión del cebador por acción de la ADN polimerasa.

En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar al disminuir la temperatura (50-65ºC). En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (formándose un fragmento de doble cadena por la complementariedad de bases) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los desoxiribonucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. 

La detección de los productos amplificados se realiza mediante una electroforesis en gel de agarosa en presencia de patrones de peso molecular. Para la visualización del ADN se utiliza bromuro de etidio que es un agente que tiene la capacidad de intercalarse entre las bases del ADN y en presencia de luz ultravioleta fluorece permitiendo observar los fragmentos de ADN amplificados (Jung et al, 1992).

La optimización de la RCP, constituye un elemento indispensable no solo a la hora de diseñar una nueva reacción, sino también cuando se introduce por primera vez en un laboratorio donde no se ha realizado con anterioridad. De forma general se optimiza la RCP para incrementar la sensibilidad, eficiencia y la especificidad de la reacción (especialmente cuando existe un gran background) y mejorar la reproducibilidad de la técnica. Se optimizan los parámetros de amplificación de la reacción con ADN purificado, así se escoge la concentración óptima de los componentes de la reacción (cebador, cloruro de magnesio, Taq ADN polimerasa) y se selecciona la temperatura para la hibridación y la duración de cada paso en el termociclador, elementos que influyen en la sensibilidad y especificad de la prueba (Weiss, 1995). 

El diagnóstico de la toxoplasmosis se ha desarrollado claramente con la introducción de la técnica de la RCP, la cual aunque no es substancial como para otras enfermedades de protozoos como Trypanosoma o Leishmania donde la sensibilidad es del 100 %, constituye un método ¨confirmatorio¨ importante cuando se usa en conjunto con otras técnicas de diagnóstico (Bastien et al, 2002). La técnica tiene la ventaja que no solo detecta directamente el ADN del parásito de forma bien específica, sino que además en un día es posible obtener los resultados. 

Se han utilizado para el diagnóstico de la enfermedad numerosos ensayos de la RCP. Para ello se han usando diferentes juegos de cebadores para varias secuencias moldes dentro del genoma de Toxoplasma. Cada uno ha sido probado, usualmente, con un número pequeño de muestras biológicas de diferentes partes del cuerpo. Desafortunadamente muy pocas investigaciones donde se comparen las secuencias moldes y los juegos de cebadores han sido publicadas (Bastien, 2002; Switaj et al, 2005). Adicionalmente los métodos de preparación de las muestras para la RCP (aislamiento del material genético de las muestras), elemento que tiene gran influencia en los resultados de la prueba, difieren entre los laboratorios, existiendo muy pocos estudios donde se comparen los mismos (Bastien, 2002; Switaj et al, 2005). Estos elementos, unido a la falta de un método estándar o regla de oro para el diagnóstico de la toxoplasmosis, ha resultado en que la sensibilidad de la técnica haya sido determinada utilizando como regla de oro métodos convencionales. En este sentido se ha utilizado la serología, la inoculación en ratones, el cultivo celular e incluso la clínica de los pacientes, indistintamente en los diferentes estudios (Switaj et al, 2005) lo que ha llevado a que sea imposible llegar a un consenso sobre la RCP óptima (secuencia molde, juego de cebadores, método para preparar las muestras) para ser utilizada en el diagnóstico. Es importante mencionar además que estas técnicas no constituyen métodos confirmatorios para el diagnóstico de la enfermedad. 

Todo esto ha hecho que sea imposible determinar la sensibilidad exacta de la prueba, la que se plantea que fluctúa en los diferentes estudios entre el 15 y el 100 % (Bastien et al, 2002). 

Los ensayos de RCP para Toxoplasma generalmente se han centrado en 4 blancos , el primero y de manera general el gen más usado es el B1 que tiene 35 repeticiones dentro del genoma del parásito con una función hasta ahora desconocida (Burg et al, 1989). Para el B1 se han diseñado diferentes juegos de cebadores para diversas regiones del gen, incluso para ensayos anidados (nested), los que se han utilizado y demostrado su utilidad en estudios clínicos (Burg et al, 1989, Van et al, 1991; Gross et al, 1992; Bretagne et al, 1995; Ostergaard et al, 1993; Verhofstede et al, 1993; Lamoril et al, 1996; Pelloux et al, 1998; Jenum et al, 1998; Pujol-Rique et al, 1999). Otro blanco ampliamente usado es la copia simple del gen P30 que codifica para el antígeno de superficie más importante del parásito P30 (Burg et al, 1988) e igualmente diversos juegos de cebadores se han diseñado para el diagnóstico (Savva et al, 1990; Dupoy-Camet et al, 1990; Weiss et al, 1991; James et al, 1996). Teniendo en cuenta la simple copia de este locus, se han desarrollado ensayos de RCP anidada para este gen (Savva et al, 1990; Johnson et al, 1993; Lee et al, 1999). Las 110 repeticiones del gen que codifica para la subunidad pequeña del ARN ribosomal ha sido usado también por varios grupos de investigadores (Cazenave et al, 1991; Guay et al, 1993; MacPherson y Gajadhar, 1993; Ostergaard et al, 1993). Más recientemente se han utilizado, aunque en menor medida, los genes de las α– tubulina (Feng y Milhausen, 1999) y β-tubulina (Costa et al, 1997).

En el año 2000, Homan y col. identificaron una secuencia de 529 pb que se repetía más de 300 veces en el genoma de T. gondii. Recientemente se demostró que esta secuencia presenta más sensibilidad al compararse con la secuencia del gen B1 utilizando la técnica de la RCP en tiempo real (Reischl et al, 2003). Otras secuencias únicas en el genoma, que incluyen los genes SAG-1, SAG-2, SAG-3, SAG-4 y GRA-4 se han utilizado como moldes para la RCP en laboratorios de investigación (Rinder et al, 1995; Meisel et al, 1996; Howe et al, 1997; Pelloux et al, 1998; Fuentes et al, 2001; García et al, 2003; Ponce y Gomez, 2003).

Como se menciono con anterioridad, un elemento importante para la realización de la RCP lo constituye el método previo donde se aísla el material genético de la muestra biológica. Como para la mayoría de los protozoos, el ADN del parásito esta embebido en una masa del ADN del huésped en donde este último esta presente varios millones de veces más y donde la presencia de determinados componentes de la muestra biológica pueden inhibir a la polimerasa. Métodos simples (lisis más ebullición y centrifugación) son eficientes para muestras biológicas que contienen pocas células y no contienen sangre, ejemplo de ello, LCR y líquido amniótico. Cuando las muestras tienen muchas células o sangre, es necesario la extracción del ADN que se puede realizar utilizando el método convencional del fenol-cloroformo o estuches comerciales (Gross et al, 1992; Romand y Thulliez, 2000; Bastien, 2002). 

La usual precaución que se tiene cuando se utiliza la RCP para el diagnóstico, es de mayor importancia en este caso, debido a la escasez de parásitos en las muestras biológicas, lo que requiere la más alta sensibilidad posible, siendo este ensayo más sensible si se evitan las contaminaciones. De ahí que hay que tener un control estricto con las normas generales para el trabajo en un laboratorio de Biología Molecular. Los controles negativos (para detectar contaminaciones de ADN) obviamente deben incluirse en cada experimento, así como controles positivos, no solo del experimento, sino también para cada muestra estudiada, para de esta forma detectar inhibidores de la reacción. Finalmente dos o tres repeticiones de los resultados positivos son necesarios para confirmar el diagnostico (Bastien, 2002). 

El futuro del diagnóstico de T. gondii en un corto tiempo será mediante el desarrollo de pruebas basadas en la RCP en tiempo real (Real time PCR) (Switaj et al, 2005), Esta técnica combina el diagnóstico y la cuantificación en muy pocos pasos. Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en un mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además mediante la detección fluorescente se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN formado (Higuchi et al, 1993). La primera gran ventaja de esta técnica sobre la RCP tradicional, es su rapidez, al no necesitar ningún proceso adicional de detección (30 – 40 min). Al utilizar sistemas cerrados, el riesgo de contaminación disminuye. Permite cuantificar la concentración inicial presente en una muestra de manera mucho más sensible, más precisa y sobre todo en un rango mucho mayor que los procedimientos convencionales, y no solo ADN sino también ARN (Bell y Ranford-Cartwright, 2002; Costa, 2004). 

La RCP en tiempo real, se ha utilizado para la detección y cuantificación de T. gondii en diferentes muestras clínicas como sangre (Reischl et al, 2003; Contini et al, 2005); líquido amniótico (Reischl et al, 2003; Roman et al, 2004), humor acuoso (Simon et al, 2004) y LCR (Reischl et al, 2003), demostrando la rapidez y la utilidad de la misma para estos fines. De esta manera ha mostrando mayor sensibilidad que los métodos de la RCP convencionales, sin embargo, la aplicación de esta técnica hoy esta limitada debido al alto costo del equipamiento necesario (Switaj et al, 2005). 

SELECCIÓN DE PRUEBAS EN GRUPOS CLÍNICOS DE PACIENTES 
Los métodos usados para el diagnóstico difieren en las distintas situaciones clínicas, según se quiera demostrar: infección adquirida en el huésped inmunocompetente, toxoplasmosis ocular, infección fetal o toxoplasmosis en el inmunodeficiente. 

Pacientes inmunocompetentes
La detección de anticuerpos específicos es el método adecuado para el diagnóstico etiológico en este grupo de pacientes. La detección de anticuerpos IgM e IgA es positivo prácticamente en el 100% de los pacientes durante los tres meses iniciales. En la gran mayoría de ellos los anticuerpos IgG suelen tener títulos elevados a partir del primer mes de infección, aunque en algunos casos pueden tardar más de tres meses en alcanzar un titulo elevado. La seroconversión o la detección de un aumento significativo del título de IgG específico entre dos muestras de suero separadas tres o cuatro semanas nos confirmara el diagnóstico de toxoplasmosis aguda (Bastien, 2002; Montoya, 2002).

Muy pocos autores han utilizado métodos moleculares para detectar el Toxoplasma en los hospederos inmunocompetentes. En pacientes con adenopatías toxoplasmicas agudas la circulación del parásito es detectada entre el 53 al 59 % de los pacientes cuando la muestra de sangre inicial es tomada durante las 5 primeras semanas de la enfermedad (Guy y Joynson, 1995; Angel et al, 1997). Bou y col. (1999), al analizar la utilidad del método en el diagnóstico de toxoplasmosis ocular en pacientes inmunocompetentes, encontraron una sensibilidad del 53 %, al analizar 15 pacientes. 

Sin embargo la mayor utilidad de la RCP en este grupo en particular sería para entender mejor la patofisiología de la enfermedad, en específico, conocer el curso de la parasitemia en pacientes asintomáticos y en aquellos con adenopatías toxoplasmicas agudas (Bastien, 2002).

Pacientes con toxoplasmosis ocular
El diagnóstico de corioretinitis por Toxoplasma usualmente se hace por la combinación de la presentación clínica, serología específica para el parásito y la detección de la producción local de anticuerpos intraoculares (Bastien, 2002). La respuesta al tratamiento específico también es un dato importante a tener en cuenta (Montoya, 2002).

El estudio serológico de anticuerpos anti-Toxoplasma ayudan poco al diagnóstico, salvo que lo alejan si es negativo. Un título bajo de anticuerpos IgG o IgM no reactivo no descartan esta etiología (Montoya, 2002; Dodds, 2003). 

En algunos pacientes la morfología de las lesiones de la retina pueden ser no diagnosticadas y/o la respuesta al tratamiento no es adecuada. En tales casos se hace necesaria la detección local de anticuerpos intraoculares y la demostración de Toxoplasma por aislamiento o histopatológia. 

La amplificación del ADN del parásito se ha usado con éxito en muestras de humor acuoso y fluido vítreo para establecer el diagnóstico en estos casos dudosos. Las sensibilidades reportadas por los métodos más recientes usando humor acuoso varían entre un 15 y un 53% (Aouizerate et al, 1993; Coignard-Chatain et al, 1996; Bou et al, 1999). Sin embargo varios estudios han demostrado que la detección de ADN de Toxoplasma, en humor acuoso, por la RCP no es más sensible que la producción local de anticuerpos intraoculares (Aouizerate et al, 1993; Coignard-Chatain et al, 1996; De Boer et al, 1996). No obstante la combinación de ambos métodos mejora considerablemente la sensibilidad del diagnóstico (Aouizerate et al, 1993; Coignard-Chatain et al, 1996).

Gestantes y perinatal
Diagnóstico de la gestante: En la embarazada el objetivo es diagnosticar las infecciones primarias que pueden causar infección fetal. El diagnóstico clínico es muy difícil ya que la mayoría de las infecciones son asintomáticas. La presencia de anticuerpos IgM e IgG detectados por métodos serológicos plantea un problema importante y de difícil interpretación. La persistencia de las IgM anti–Toxoplasma, durante meses e incluso años hace que esta determinación sea útil tan solo como cribado, para localizar las posibles infecciones agudas, pero la invalida para confirmar el diagnóstico. Una situación similar ocurre con las IgA específicas, que parecían aportar una ayuda en este tipo de infecciones, pero que siguen una cinética paralela a la de las IgM. En estos casos es obligada la cuantificación de las IgG en una segunda muestra de suero tomada a las 3-4 semanas de la primera. Un aumento significativo del titulo de anticuerpos IgG entre dos muestras procesadas en paralelo, es diagnóstico de certeza de infección aguda materna. Este incremento solo se observara en aquellas gestantes en las que el control se haya realizado en la fase inicial de la infección, situación poco frecuente por lo que la no elevación del titulo de IgG no puede descartar la infección durante ese embarazo (Montoya, 2002; Lappalainen y Hedman, 2004). 

Otra técnica que puede tener utilidad para catalogar una infección aguda es el estudio de la avidez de la IgG (Hedman et al, 1989). El método se basa en la distinta fuerza de la unión entre antígeno y anticuerpo en la infección aguda y en la crónica por T. gondii. Algunos estudios han demostrado que durante las 20 primeras semanas después de la infección predominan las IgG de baja avidez, por lo que ha de interpretarse como altamente sugestivo de infección aguda, mientras que el predominio de las IgG de alta avidez, sería indicativo de infección pasada (Hohlfeld et al, 1994; Remington et al, 2001; Montoya, 2002; Remington et al, 2004). 

Diagnóstico prenatal: Si el diagnóstico de infección materna se confirma, lo más importante, después de instaurar tratamiento para disminuir el riesgo de transmisión vertical, es precisar si existe o no infección fetal. Para esto se debe realizar el control ecográfico para valorar en el feto las lesiones compatibles con una infección por Toxoplasma (calcificaciones cerebrales e hidrocefalia). Aquí ha de tenerse en cuenta que entre el 60- 70 % de los casos en los que el feto está afectado esta exploración puede ser normal, por lo que esto contribuye al diagnóstico pero no es concluyente, de ahí la necesidad de estudiar la presencia del parásito en muestras fetales (sangre fetal y líquido amniótico). 

Teóricamente, tanto una como la otra son adecuadas para el diagnóstico de la infección congénita, pero es aconsejable el líquido amniótico, dada la menor morbilidad de la amniocentesis con respecto a la funiculocentesis y la dificultad técnica de realizar esta última antes de las 18 semanas. Además el estudio de la sangre fetal puede producir falsos negativos, tanto en el aislamiento del parásito (parasitemia intermitente), como en la detección de anticuerpos específicos, debido a la inmadures inmunológica del feto. Así mismo la presencia de IgM en sangre fetal también puede inducir a errores, como consecuencia de una perforación placentaria o de la contaminación con sangre materna en el momento de la toma de la muestra (Sierra et al, 2004).

Aunque aun se precisan otros estudios para confirmarlo, la detección de la presencia del Toxoplasma en líquido amniótico mediante la técnica de la RCP parece ser un procedimiento diagnóstico rápido y seguro (Hohlfeld et al, 1994; Ambroise-Thomas y Petersen, 2000; Bastien, 2002; Remington et al, 2004). Las muestras de sangre fetal cayeron rápidamente en desuso debido al adelanto significativo en la sensibilidad para la detección del parásito en liquido amniótico y la disminución del riesgo fetal (Bastien, 2002).

Se han reportado varios rangos de sensibilidad de la RCP por diferentes autores, pero hasta el momento la sensibilidad usando líquido amniótico, en centros especializados puede ser estimada entre un 70 y un 80% independientemente del tipo de ensayo de RCP usado (Bastien, 2002). La especificidad de la RCP para el diagnóstico prenatal nunca ha sido menor del 94% y frecuentemente alcanza el 100% (Bastien, 2002). A pesar de la relativa alta tasa de resultados falsos negativos que se producen, la RCP es una prueba sensible y especifica que reduce considerablemente el tiempo para obtener los resultados (Bastien, 2002).

En cuanto a la inoculación en ratones y el cultivo celular, métodos convencionales que han sido utilizados para el diagnóstico prenatal, se ha demostrado que tienen menor sensibilidad que la RCP (Remington et al, 2004; Sierra et al, 2004).

Diagnóstico post-natal: El diagnóstico neonatal es esencial para compensar los resultados falsos negativos que se producen en el diagnóstico prenatal. Este se basa en tres aspectos diferentes: la sintomatología, los datos serológicos y la detección del parásito o su ADN. 

La toxoplasmosis congénita en el recién nacido se diagnostica comúnmente por la demostración de IgM o IgA en el suero del infante. Sin embargo hay que tener mucho cuidado al evaluar estas inmunoglobulinas pues aunque la IgG es el único anticuerpo que puede atravesar la placenta, se sabe que en el momento del nacimiento puede ocurrir la transmisión de anticuerpos maternos de tipò IgM o IgA (Remington et al, 2004). La demostración de anticuerpos IgA parece ser más sensible que la detección de anticuerpos IgM para establecer una infección en el recién nacido (Stepick-Biek et al, 1990). Además la IgA puede estar presente cuando no lo estén las IgM. Si los anticuerpos IgA son detectados en el recién nacido la prueba debe ser repetida a los diez días para confirmar que estos no sean producto de una contaminación con anticuerpos maternos. Es importante destacar que el niño puede tener una infección congénita con ausencia de IgM e IgA. Mediante técnicas de IFI y ELISA es posible detectar IgM o IgA en un 75 % de los recién nacidos con toxoplasmosis congénita (Sierra et al, 2004).

En cuanto a la IgG, es imprescindible poder descifrar si esta es debida a la transmisión pasiva de la madre al feto o como resultado de la propia respuesta inmune del niño. Para esto se deben realizar pruebas mensuales para la IgG, donde si esta llega a mantenerse en un titulo fijo indica una infección del niño mientras que si se negativiza descartaría la infección congénita (Sierra et al, 2004). 

Otro de los métodos utilizados para el diagnóstico de infección en el recién nacido es el Western blots de sueros pareados de la madre y el niño. En estudios publicados en 1985, Remington demostró que existían bandas claramente demostrables de la IgM e IgG en sueros de infantes que no estaban presentes en los sueros de sus madres, de manera que este método podría brindar información para la discriminación entre anticuerpos propios del recién nacido y aquellos que pudieran haber sido transferidos de la madre al niño. Su principal utilidad parece ser en aquellos recién nacidos en los que la IgA e IgM no son demostrables por los métodos serológicos convencionales y cuyas madres tienen definitiva o alta sospecha de infección aguda adquirida durante la gestación. Sin embargo debe ser utilizado siempre en conjunto con otros métodos serológicos como ELISA (IgM o IgA) o Ensayos de Aglutinación en fase sólida (ISAGA). (Remington et al, 2004)

Otros métodos diagnósticos adicionales han sido usados exitosamente, para el diagnóstico de infección en los infantes como la inoculación en ratones de laboratorio o la inoculación en células de cultivo para lo que se ha utilizado LCR, sangre periférica, placenta u orina (Remington et al, 2001).

Muy pocos autores han utilizado métodos moleculares para detectar el parásito en muestras de placenta, sangre de cordón o de los neonatos (LCR u orina) (Bastien, 2002). En los recién nacidos se usa ocasionalmente sangre periférica con buenos resultados en la RCP (Fuentes et al, 1996; Bergstrom et al, 1998). Utilizando sangre de cordón la sensibilidad de la prueba se ha reportado muy baja (Candolfi y Pelloux, 2000; Bastien, 2002). Otra alternativa bien interesante y no invasiva es la de utilizar muestras de orina para el ensayo de la RCP (Fuentes et al, 1996), pero se necesita comprobar con un mayor número de muestras (Bastien, 2002). En estos momentos es todavía difícil evaluar el valor de la RCP en el diagnóstico neonatal aunque su principal utilidad es que acelera el diagnóstico parasitológico cuando la serología es insuficiente para diagnosticar la infección (Bastien, 2002). 

Ante un recién nacido con un diagnóstico de toxoplasmosis congénita probable o segura, es necesario realizar un análisis serológico e intentar completarlo con la RCP, o si es posible, el aislamiento del parásito (Sierra et al, 2004). El diagnóstico precoz es esencial para iniciar tratamiento evitando la progresión de la enfermedad y las formas tardías de la misma con una disminución de las secuelas (Sierra et al, 2004).

Pacientes inmunodeprimidos
En los pacientes inmunodeprimidos, en general, la localización más frecuente de la toxoplasmosis es la cerebral en el 98 % de los casos, seguida de las formas oculares y pulmonares (Israelski y Remington, 1993). Dentro de los pacientes inmunodeprimidos un grupo especial lo constituyen los enfermos con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), en los que esta enfermedad es una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad (Luft y Remington, 1992).

El diagnóstico definitivo de la toxoplasmosis cerebral requiere la demostración de trofozoitos en biopsias de cerebro, sin embargo es un procedimiento muy invasivo para el paciente y no es adecuado para el uso rutinario (Antinori et al, 1997; Segura et al, 1999). El diagnóstico presuntivo se basa en la positividad a pruebas para anticuerpos anti-T. gondii, signos clínicos, síntomas sugestivos de disfunciones del Sistema Nervioso Central (SNC) y lesiones típicas en el cerebro detectadas por la Tomografía Axial Computarizada (TAC) o Resonancia Magnética Imagenológica (RMI) (Luft y Remington, 1992; Eggers et al, 1995; Cohen, 1999; Luft y Chua, 2000; Bahia-Oliveira et al, 2003; Vidal et al, 2004). Esta última tiene la capacidad de ser más sensible para detectar pequeñas lesiones que no se visualizan con la TAC. El principal inconveniente de estas técnicas radica en que las imágenes cerebrales observadas pueden ser similares a las de otras enfermedades cerebrales que se producen en los pacientes infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), como el linfoma cerebral (Ciricillo y Rosenblum, 1990; Raffi et al, 1997).

Detectar los niveles de anticuerpos anti-Toxoplasma no constituyen un método confirmatorio para el diagnóstico de esta parasitosis en el infectado por el VIH, aunque resulta útil el hallazgo de una serología negativa pues aleja ese diagnóstico, ya que solo menos del 3- 6% de los pacientes con toxoplasmosis tienen resultados negativos a pruebas inmunológicas (Antinori et al, 1997; Raffi et al, 1997; Priya et al, 2002; Nissapatorn et al, 2004). La toxoplasmosis en estos pacientes puede ocurrir con bajos niveles de anticuerpos anti-Toxoplasma y raramente están presentes las IgM específicas. Esto se debe a la incapacidad del enfermo inmunodeprimido de formar nuevos anticuerpos durante las enfermedades agudas (Montoya, 2002; López y Bolotner, 2003). La IFI y el ELISA son las técnicas más empleadas para estos fines (Skiest, 2002). Vidal y col. (2004) utilizaron muestras de LCR para detectar la presencia de anticuerpos anti-Toxoplasma de tipo IgG mediante la técnica de IFI, encontrando que los pacientes negativos a anticuerpos anti-Toxoplasma no presentaban encefalitis toxoplasmica (ET) y todos los pacientes con ET presentaban títulos de anticuerpos, correlacionándose con los resultados de la RCP, lo que esta en concordancia con estudios previos (Potasman et al, 1988; Pelloux et al, 1997; Alonso et al, 2002). Borges y col (2004), demostraron igualmente que la ausencia de anticuerpos anti-Toxoplasma en LCR de pacientes con SIDA aleja el diagnóstico de la ET. Estos resultados demuestran que la combinación de la RCP y métodos serológicos puede ser una buena herramienta par el diagnóstico temprano e instauración del tratamiento oportuno. 

Por otro lado las técnicas de detección directa del parásito en sangre o LCR tales como el cultivo en células de fibroblastos o la inoculación en ratones de laboratorio consumen mucho tiempo y tienen una baja sensibilidad (Lamoril et al, 1996; Raffi et al, 1997).

En la práctica se admite que frente a la sospecha clínica de neurotoxoplasmosis se inicie tratamiento contra Toxoplasma. La mejoría clínica-radiológica del paciente en un plazo medio de 10 días, es un elemento a favor de ese diagnóstico etiológico (Cirillo et al, 1990; Raffi et al, 1997; Micheli, 2000). 

Ante todas estas dificultades la técnica de la RCP ha ayudado considerablemente al diagnóstico de la toxoplasmosis en este grupo de pacientes, detectando directamente el ADN del parásito en la muestra estudiada, de manera rápida y a través de la utilización de fluidos biológicos obtenidos de manera menos invasiva que las biopsias de cerebro como son el LCR o la sangre (Montoya et al, 1996). Es importante destacar que a pesar de que existe una gran diversidad de métodos de la RCP usados, la mayoría de los estudios se refieren esencialmente a ensayos con el gen B1 (Bastien, 2002).

En los casos de ET, utilizando muestras de sangre periférica se han reportado sensibilidades que oscilan entre un 16 y un 86%, independientemente del tipo de ensayo de la RCP usado (Bastien, 2002). Bastien (2002), realizó una recopilación de los datos obtenidos por diferentes autores donde determina la sensibilidad de la RCP en pacientes SIDA, reportando un valor del 42 % (43 de 102 pacientes analizados). 

Con muestras de LCR se han reportado sensibilidades tan bajas como de un 17% logrando llegar a un 100 % cuando se utilizan ensayos de la RCP-anidada (Bastien, 2002) o incluso simples RCP con determinados juegos de cebadores específicos (B21/B22) (Vidal et al, 2004). En la recopilación de los datos realizados por Bastien (2002), se reporta un valor del 59 % como sensibilidad promedio (97 de 164 pacientes con ET). Es de notar que estas sensibilidades se reducen rápidamente a valores muy bajos cuando la muestra (sangre o LCR) para la RCP es tomada una vez iniciado el tratamiento antiparásitario (Bastien, 2002). En cuanto a la especificidad, usualmente alcanza valores cercanos al 100%, lo cual convierte a la RCP en una técnica extremadamente específica. 

A pesar de la variable sensibilidad reportada para la RCP, su alta especificidad y los valores predictivos positivos la convierten en una potente herramienta para el diagnóstico de la ET en pacientes inmunodeprimidos, complementándose el diagnostico con criterios clínicos y radiológicos (Antinori et al, 1997; Bastien, 2002). 

El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) ha establecido tres criterios fundamentales para definir un paciente con ET, donde se incluye: (1) la iniciación reciente de anormalidades neurológicas focales con enfermedades intracraneales o reducción de los niveles de conocimientos, (2) lesiones hipodensas evidenciadas por imágenes del cerebro (TAC, RMI) y (3) prueba positiva a anticuerpos anti-Toxoplasma o la favorable respuesta al tratamiento contra la ET (CDC, 1993). Estos criterios se han considerado por varios autores como la regla de oro para definir un paciente con ET (Priya et al, 2002; Vidal et al, 2004).

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.AUTORES
Jorge Fraga* y Yenisey Alfonso.

Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Parasitología. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Autopista Novia del Mediodía km 6 ½, Apartado Postal 601. Marianao 13. Ciudad de La Habana. Cuba.
*e-mail: fraga@ipk.sld.cu


Enviado por Jorge Fraga y Yenisey Alfonso
Contactar mailto:fraga@ipk.sld.cu


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Publicado Friday 15 de December de 2006