Resumen
El cultivo del clavel, es prácticamente inexistente en nuestra Provincia, no se dispone de germoplasma, ni de diversificación de especies y/o variedades. Diferentes concentraciones de Pectimorf, fueron añadidas al medio de cultivo de enraizamiento in vitro con el objetivo de evaluar su efecto en el enraizamiento y posterior aclimatización de las plantas de clavel propagadas in vitro. Se tomaron plantas enraizadas in vitro, provenientes de 3 concentraciones de Pectimorf (5,0; 10 y 15 mg.l-1). Las cuales fueron ubicadas para su adaptación en condiciones semi-controladas de casa de cultivo a temperatura de 30-34oC, iluminación de 60 µmol.m2s y humedad relativa de 80%. Desde los 14 a 70 días posteriores al transplante, se evaluó: longitud de las plantas y número de hojas por planta. A los 70 días se determinó: área foliar de las plantas y porcentaje de supervivencia de las plantas. Se aplicó un diseño experimental completamente aleatorizado con un análisis de varianza de clasificación simple y la prueba de Duncan (p<0.01) para las comparaciones múltiples de medias. Los mejores resultados para las variables longitud de las plantas, número de hojas por planta y área foliar, se alcanzaron cuando se utilizó medio de cultivo MS+15 mg.l-1 de Pectimorf lográndose un 100% de supervivencia.

Palabras clave: enraizamiento, aclimatización, in vitro, medio de cultivo, clavel.

Abstract
Different concentrations of Pectimorf were added to the in vitro culture medium with the objective of evaluate its effect on the roots formation and later acclimatization of carnation plantlets propagated in vitro. Were taken in vitro rooted plants wich came from 4 concentrations of Pectimorf (0,0; 5,0; 10 ; 15 mg.l -1) adapted under semi-controlled conditions on green house at a temperature of 30-34 oC, 60 µmol.m2s of illumination and 80% of relative humidity . After 14 to 70 days of transplant the length of plants and number of leaves per plant was evaluated. At 70 days the foliar area and the survival percentage of the plants was determined. A completely randomly experiment design with a variance analysis of simple classification was applied and test of Duncan (p<0, 01) for the multiple comparison of medias by means of the Statistic Program version 4.2 for Windows. The best results for the variables: plant length, leaf number per plant and foliar area were obtained from plants growth on culture medium MS+ 15 mg.l -1 of Pectimorf having achieved. A 100% of survival resulted on plants growth in culture medium with 15 and 10 mg.l -1 of Pectimorf respectively.4900 plants obtained in vitro were given to small farmers of urbane agriculture of Bayamo municipality.

Key words: roots formation, acclimatization, in vitro, culture medium.


Introducción
La producción mundial de Flores ocupa más de 190.000 ha, alcanzando un valor de más de 16.000 millones de dólares. La mayoría de las zonas productoras se hallan en los principales mercados de consumo o cerca de ellos. Entre los países más productores encontramos a Holanda con 7.378 ha, Estados Unidos con 20,181ha y Japón con 17,589 ha. Estos tres países controlan aproximadamente el 50% del valor de la producción y más del 20% del área de la producción a nivel mundial, comercializándose fundamentalmente como flor cortada. Las grandes regiones consumidoras de flor cortada del mundo son Europa Occidental, Japón y Estados Unidos.

El consumo de flores y plantas ornamentales actualmente estimado en 44 millones de dólares, se piensa que continuará creciendo, ya que la población mundial aumenta y se mueve progresivamente hacia las áreas urbanas, lo cual también favorecerá en el futuro el consumo de flores (Cortes, 2004).

Una de las flores más cotizadas como flor cortada a nivel mundial es el clavel (Pinto, 1988). En Cuba, a pesar de que las flores constituyen un renglón cotizado por la población su producción se ha deprimido por múltiples factores. En la actualidad se están realizando ingentes esfuerzos para rescatar la tradición de su cultivo (Montes, 1997). Particularmente en la provincia Granma, es prácticamente inexistente, no se dispone de germoplasma, ni de diversificación de especies y/o variedades, ni de material de propagación en los niveles requeridos, así como, de tecnología para desarrollar la producción intensiva de este cultivo en condiciones de la Agricultura Urbana.

Debido a la necesidad de establecer una tecnología eficiente para la propagación acelerada del cultivo del clavel en condiciones in vitro y ex vitro, que garantice elevar los niveles de productividad de este cultivo, el cual reviste una gran importancia en el mercado, por su valor y demanda tanto ornamental como de flor de corte, se realiza este trabajo, con el objetivo de: lograr una mayor eficiencia durante el enraizamiento in vitro y posterior aclimatización de las vitroplantas de clavel, que permita la obtención y entrega de plantas de alta calidad. Para lo cual se trazaron como objetivos específicos:

Determinar la concentración más adecuada de pectimorf para el medio de cultivo de enraizamiento in vitro.

Evaluar el efecto de las diferentes concentraciones de pectimorf, en la aclimatación de vitroplantas de clavel.

Materiales y Métodos
Se utilizaron segmentos nodales (explantes primarios) de la especie Dianthus caryophyllus L. establecida en condiciones de macetas (González, 1996) por un período de 3 meses.

Fase de enraizamiento en condiciones in vitro

Desinfección y establecimiento in vitro
Se emplearon segmentos uninodales de 10-12 mm de longitud, los cuales luego de seleccionados, fueron sometidas a una desinfección para la eliminación de los microorganismos contaminantes. Se sumergieron en una solución de detergente al 1.0 % durante una hora, después se realizaron 3 enjuagues en agua destilada. Posteriormente en condiciones asépticas en el flujo laminar se introdujeron en una solución de hipoclorito de sodio (1.0%) durante 10 minutos, seguido de 3 enjuagues en agua destilada estéril. Finalmente estos explantes fueron establecidos en condiciones in vitro en el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962).

Medio de cultivo
El medio de cultivo estuvo compuesto por: sales macronutrientes; sales micronutrientes y hierro según Murashige y Skoog (1962), hidrocloruro de tiamina 10 mg.l-1 sacarosa 40 g.l-1, mio-inositol 100 mg.l-1 como tratamiento control y modificado con la adición de pectimorf en las siguientes concentraciones: 5 mg.l-1 (tratamiento 2), 10 mg.l-1 (tratamiento 3), 15 mg.l-1 (tratamiento 4). El pH se ajustó a 5.7. El medio se distribuyó a razón de 20 ml por frasco, y se esterilizó a 1210C durante 25 minutos.

Inoculación de los explantes
La inoculación de los explantes se realizó con la polaridad correcta a razón 10 explantes /frascos, con 20ml de medio de cultivo.

Condiciones del cultivo
Temperatura de 27 0C, humedad relativa de 76 –80% e iluminación 60mol/m2.

Evaluación
A las cuatro semanas del cultivo se evaluó:
• Número de raíces por planta
• Longitud de la planta

Fase de aclimatización

Transplantes de las vitroplantas a condiciones de casa de cultivo
Se tomaron las vitroplantas obtenidas provenientes de cada tratamiento, se lavaron las raíces para eliminar los restos de agar y de medio de cultivo en general. Se dejaron durante un día en agua hasta su siembra en las condiciones de casa de cultivo. Posteriormente se plantaron sobre una mezcla de suelo, arena lavada o artificial (1:1).

Se sembró una vitroplanta por pocillo de la bandeja (alveolo). Diariamente se realizó un riego por aspersión en horas de la mañana, durante los 70 días que fueron mantenidas bajo condiciones semi-controladas.

Condiciones del cultivo
Temperatura de 30-4 oC, iluminación de 60 mol /m2s y humedad relativa de 80%.

Evaluación
Estas mediciones se realizaron cada dos semanas (14 días), después del transplante, se determinaron hasta los 70 días en la fase de aclimatización, los siguientes indicadores:
• Longitud de las plantas.
• Número de hojas por planta.

Al cabo de los 70 días de haber establecido el experimento en la fase de adaptación se determinó:
• Porcentaje de supervivencia.
• Área foliar de las plantas.

Análisis Económico
El análisis económico se realizó en base a la comparación del mejor tratamiento obtenido con el medio testigo, compuesto por el medio MS sin adición de pectimorf, para la producción de 1000 vitroplantas de clavel, para lo cual se tuvieron en cuenta los elementos de gastos básicos de la ficha de costo para la producción de vitroplantas de clavel tales como: reactivos, agua, electricidad, salario (básico, complementario, seguridad social), depreciación y gastos indirectos.
También se analizó el efecto económico del ahorro producido por el mejor tratamiento obtenido para un escalado comercial de 1 000 000 de vitroplantas.

Diseño y Análisis Estadístico
En los experimentos de micropropagación y aclimatización, se aplicó un diseño completamente aleatorizado con un análisis de varianza de clasificación simple y prueba de comparación múltiples de medias para determinar el efecto de la adicción del pectimorf en el medio de cultivo sobre el enraizamiento y adaptación de vitroplantas de clavel. En los experimentos in vitro se utilizaron 20 repeticiones por cada tratamiento, y en los de adaptación de las vitroplantas 20 repeticiones por cada variante. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete “Statistica for WINDOWS”, versión 4.2 (StatSoft, 1993).

Resultados y Discusión

Efecto de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel

Longitud del vástago:
En la figura 1 se ilustra los resultados del efecto de la adición de las diferentes concentraciones de pectimorf sobre la longitud del vástago de las vitroplantas en la fase de enraizamiento in vitro a los 30 días, donde a medida que se incrementa la concentración de pectimorf en el medio de cultivo, aumenta la longitud de la planta, correspondiendo el mayor valor (18.1 mm) al tratamiento 4 compuesto por el medio MS + 15 mg.l de pectimorf, el cual difiere significativamente (p  0.001) del resto de las variantes evaluadas y estas a su vez difieren sucesivamente de forma significativa unas de otras.



Figura 1. Influencia de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro sobre la longitud del vástago de vitroplantas de clavel (Dianthus caryophyllus).

Estos resultados son superiores a los alcanzados por Villalobos y García (1982) usando como regulador del crecimiento AIA 10mg.l-1 y Kinetina en igual proporción, lograron plántulas provenientes de meristemas apicales en longitudes de 16 mm, en tanto que en los provenientes de yemas axilares, el rango de crecimiento solo fue de 11mm a los 32 días de sembrados in vitro.

En este sentido debemos plantear que el crecimiento de tejidos in vitro es reconocido como una reacción a los niveles endógenos de hormonas, tanto del tipo citoquinina, auxinas, geberelinas como a los demás factores de crecimiento.


Número de raíces:
La variable: número de raíces (figura 2) de forma general, presentó un comportamiento similar a los resultados obtenidos para la longitud de la planta en la fase de enraizamiento in vitro , no obstante, a pesar de observarse una tendencia al aumento del número de raíces en la medida que se adicionaba mayor concentración de pectimorf en el medio, este efecto fue solamente altamente significativo (p< 0.001) para el tratamiento 4, alcanzándose el valor más elevado (6.65)de esta variable. El resto de los tratamientos evaluados no presentaron diferencias estadísticas entre ellos ni con el control.

Estos resultados son similares a los obtenidos por: Falcón y Cabrera (2000), en el cultivo de violeta africana (Saintpaulia Ionantha) al evaluar el efecto del Pectimorf en la formación y desarrollo de raíces en pecíolos de violetas, encontrándose que los tratamientos con la mezcla de oligosacarinas aceleraban en una semana la aparición de raíces en la base del peciolo en relación con el testigo.



Figura 2. Influencia de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro sobre el número de raíces de vitroplantas de clavel (Dianthus caryophyllus).

Con relación a la emisión de raíces, Villalobos y García (1982), apreciaron variación en las evaluaciones efectuadas a los 35 días en el cultivo del clavel, detectando que en el tratamiento I, los meristemas apicales y laterales alcanzaron un 50% de las plantas enraizadas. De igual forma, Wetztein y Sommer (1988) observaron la formación de raíces en ápices y yemas de clavel en un 48% independiente del tejido.

Influencia de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel y su efecto en la fase de aclimatización de las mismas a condiciones naturales

Número de hojas:
Los resultados de la influencia de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel y su efecto en la fase de aclimatización de las mismas a condiciones naturales, sobre el número de hojas evaluadas cada 14 días hasta 70 días, se muestra en la figura 3, en la cual se aprecia un incremento de este parámetro con el tiempo y con el aumento de la concentración de pectimorf en el medio de enraizamiento de las vitroplantas, provoca un efecto altamente significativo (p< 0.001) en las plántulas que provienen del medio MS+15mg.l pectimorf (tratamiento 4) con valores promedio de 21 hojas/plántulas, las que difieren del resto de los tratamientos, seguida del tratamiento 3 (Medio MS+10mg.l pectimorf) que difiere del tratamiento 2(MS+ 5mg.l pectimorf) y el tratamiento 1(Medio MS), control.



Figura 3. Efecto de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel (Dianthus caryophyllus) a los 14, 28, 42, 56 y y su influencia sobre el número de hojas fase de aclimatización.

Altura de las plántulas:
En la figura 4 se presenta los valores del efecto de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel y su influencia en la altura de las plántulas en la fase de aclimatización de las mismas a condiciones naturales. Como se aprecia este indicador fue evaluado cada 14 días hasta 70 días, el cual mostró un comportamiento semejante al número de hojas (figura 3), con un aumento en el tiempo y con el de la concentración de pectimorf en el medio de enraizamiento de las vitroplantas, que provoca una influencia altamente significativa (p< 0.001) en las plántulas que provienen del medio MS+15mg.l pectimorf (tratamiento 4) con valores promedios de 90 mm a los 70 días, las que difieren del resto de los tratamientos, seguida del tratamiento 3 (Medio MS+10mg.l pectimorf) que difiere del tratamiento 2(MS+ 5mg.l pectimorf) y el tratamiento 1(Medio MS), control.



Figura 4. Efecto de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel (Dianthus caryophyllus) y su influencia sobre la altura de las plántulas a los 14, 28, 42, 56 y 70 días en la fase de aclimatización.

En los resultados obtenidos, se presentó un crecimiento y desarrollo vegetativo del tallo y de las hojas, expresado en el crecimiento en longitud del tallo y la formación de las hojas lo cual es producto a una importante actividad de crecimiento y diferenciación desplegada por los tejidos meristemáticos de las vitroplantas, aspecto vital para lograr su adaptación y necesario endurecimiento para el transplante y establecimiento con la calidad biológica requerida en condiciones de campo.

En este aspecto Purves et al. (1998) señalan que estos órganos vegetativos provienen de divisiones celulares sucesivas en el seno de los tejidos meristemáticos, seguido de la expansión de las células y su diferenciación; cada tallo o rama contiene una yema apical la cual produce las células necesarias para el crecimiento y desarrollo del mismo, el meristema apical caulinar produce igualmente los primordios foliares que crecen y dan lugar a las hojas, los tallos exponen las hojas al sol de manera que se optimice su rendimiento fotosintético y a la ves aseguran la comunicación para el transporte de sustancias entre las raíces y las hojas, estas últimas son las responsables de la principal actividad fotosintética, produciendo de esta forma los nutrientes requeridos para el desarrollo de los distintos procesos biológico de la planta y liberando el oxigeno gaseoso, también igualmente efectúan las reacciones metabólicas que suministran a la planta el nitrógeno necesario para los procesos de síntesis de proteicas y de loa ácidos nucleicos, componentes esenciales para lograr un crecimiento y desarrollo vegetativo satisfactorio.

Área foliar:
La influencia de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel y su efecto en la fase de aclimatización de las mismas a condiciones naturales, sobre el área foliar de las plántulas evaluada a los 70 días, se muestra en la figura 5, en la cual se observa un incremento de esta variable con el aumento de la concentración de pectimorf en el medio de enraizamiento de las vitroplantas, con un comportamiento similar a las variables estudiadas anteriormente para esta fase, donde se demuestra un efecto altamente significativo (p< 0.001) en las plántulas que provienen del medio MS+15mg.l pectimorf (tratamiento 4) con valores promedio de 30 cm2, las que difieren del resto de los tratamientos, seguida del tratamiento 3 (Medio MS+ 10mg.l pectimorf) que difiere del tratamiento 2 (MS+ 5mg.l pectimorf), y el tratamiento 1(Medio MS)(control), y el tratamiento 2 que difiere del 1.



Figura 5. Efecto de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel (Dianthus caryphyllus) y su influencia sobre el área foliar de las plántulas a los 70 días en la fase de aclimatación.

En el experimento se observa que el establecimiento es rápido; el área foliar máximo se alcanza en los diferentes tratamientos una vez transcurrido los 70 días y son necesarios para que después de la siembra se halla obtenido el área foliar máxima, según Santa Olalla Mañas et al., 1992, de forma general la superficie foliar se reduce con el periodo vegetativo ya que las hojas nuevas crecen y se desarrollan más lento y las hojas viejas mueren más rápido.

Aclimatización de vitroplantas de clavel
La Aclimatización, que aparentemente es un proceso sencillo, se torna extremadamente complejo, pues son muchos los elementos a tener en cuenta para una terminación exitosa de la misma; además en algunos casos los resultados obtenidos para una especie de planta no pueden ser extrapolados a otras.

Supervivencia:
Las vitroplantas procedentes de la fase de enraizamiento in vitro fueron transferidas a la fase de Aclimatización en condiciones de casas vegetativas mostrando valores satisfactorios de supervivencia correspondiente a 90, 95, 100 y 100% para los tratamientos 1, 2, 3 y 4 respectivamente (figura 6) y un desarrollo biológico normal de las plántulas, lo que corrobora lo planteado por Huerres y Carballo (1998) que más del 85% se consideraban buenos en semilleros y en los centros de reproducción acelerada de semillas.

Estos resultados se asemejan con los reportados por Degras et al. (1986) en la adaptación y endurecimientos de vitroplantas de D. alata en condiciones de casa de vegetativa durante 6 semanas donde obtuvieron 90% de supervivencia.



Figura 6. Efecto de la adición de pectimorf en la fase de enraizamiento in vitro de vitroplantas de clavel (Dianthus caryophyllus) y su influencia sobre el porcentaje de supervivencia de las plántulas a los 70 días en la fase de aclimatización.

También son similares a los alcanzados por Cabrera et al. (1999) en la aclimatización de vitroplantas de yuca (Manihot esculenta Crantz), donde lograron porcentajes de supervivencia superiores al 90% en un sustrato compuesto por 100% de cachaza y protegido las vitroplantas con un frasco de vidrio los primeros seis días, de esta forma las plantas estaban preparadas para ser transplantadas a los 45 días.

Por otro lado Ramírez et al. (1999) señalan que lo más importante en la aclimatización es garantizar que las plantas que se extraen del ambiente controlado no mueran, es decir, alcanzar altos porcentajes de supervivencia debido a que esta fase es trascendental para la propagación comercial, pues del resultado de esta, dependerá en gran medida la calidad final de las plantas y la eficiencia total del proceso, que sin duda es la más importante en la micropropagación.

Es necesario señalar que en el proceso de aclimatización es muy difícil que no ocurran muertes las cuales pueden ser atribuidas según Van Huylenbroeck (2000), a que durante la transferencia de las plantas micropropagadas a las condiciones ex vitro estas son susceptibles a varios estreses debido a que no han desarrollado aún patrones adecuados de distribución de recursos y las características morfológicas y fisiológicas adecuadas para el nuevo sistema de mantenimiento de agua. También durante la aclimatización se observa un cambio en el funcionamiento de los estomas y en la composición de la cutícula.

La aclimatización aparentemente, un proceso sencillo, se torna extremadamente complejo, pues son muchos los elementos a tener en cuenta para una terminación exitosa de la misma; además en algunos casos los resultados obtenidos para una especie de planta no pueden ser extrapolados a otras.

Valoración Económica de los Resultados
Los resultados del análisis económico sobre la base de la comparación del mejor tratamiento obtenido con el medio testigo, compuesto por el medio MS sin adición de pectimorf, para la producción de 1000 vitroplantas de clavel, se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Efecto económico del ahorro producido por el mejor tratamiento obtenido correspondiente al medio MS +15 mg.l-1de pectimorf (tratamiento 4) en comparación con el testigo compuesto por el medio MS (tratamiento 1) para la producción de 1000 plántulas de clavel.



También se analizó el efecto económico del ahorro producido por el mejor tratamiento obtenido para un escalado comercial de 1 000 000 de vitroplantas.

Tabla 2. Efecto económico del ahorro producido por el mejor tratamiento obtenido para un escalado comercial de 1 000 000 de vitroplantas.



Impacto Económico y Social del resultado obtenido
Como resultado de esta investigación, se logra una metodología para la propagación acelerada del cultivo del clavel, que ahorra 11 700 MN y 434 MLC para un escalado comercial de 1 000 000 de vitroplantas. Lo cual permite con menos costos, con el empleo de un producto cubano, que sustituye la utilización de auxinas que se comercializan sólo en MLC, altos niveles de producción de plantas de alta calidad de esta especie. La cual, que en condiciones ambientales, es atacada frecuentemente por enfermedades pricipalmente por hongos (Fusarium sp.), lo que trae consigo grandes pérdidas en la producción y por consiguiente disminución de las ganancias por concepto de ventas, tanto a organismos como a la población.

Se logra además el fortalecimiento de este subprograma de la agricultura urbana en el municipio Bayamo, aumentando las ofertas a la población, ya que la demanda de flores es cada vez más creciente.

Con el desarrollo de este trabajo además, se originan nuevas fuentes de empleo, sobre todo para la mujer, tanto para el trabajo técnico de laboratorio como la extensión de los resultados en condiciones de organopónico y huertos intensivos. Lo cual constituye un gran impacto social en el municipio Bayamo, que puede expenderse en varios municipios de la provincia y en otras provincias, mediante el desarrollo de proyectos conjuntos, para el desarrollo de este subprograma en nuestro país.

CONCLUSIONES
1. El método más adecuado para el enraizamiento in vitro y posterior aclimatización exitosa de vitroplantas de clavel (Dianthus caryphyllus) sobre la base de la adición al medio de cultivo del biorregulador pectimorf corresponde al medio MS + 15 mg.l de pectimorf.

2. La aplicación del medio MS + 15 mg.l-1 de pectimorf a la propagación de un millón de vitroplantas de clavel (Dianthus caryphyllus) a escala comercial produce un efecto económico de 434 MLC y 11700.

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Enviado por Lillien Fajardo Rosabal, Yandila Blanco Batista, Misterbino Borges García, Dairon Fonseca Castillo, Yanet Hernandez Jerez, Leidys Arceo Elías
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Publicado Friday 7 de October de 2011