RESUMEN:
En este trabajo se aborda la determinación de seis drogas antirretrovirales para el VIH, y una retroviral para el tratamiento de la influencia. En el mismo se expresa una valoración de su actividad antirretroviral, las condiciones experimentales óptimas para la determinación de cada droga, sus límites de detección, y algunas consideraciones de la similitud y diferencia en el comportamiento de cada una en el análisis

Palabras llave: Drogas antirretrovirales, voltametría “stripping”, electrodo de film de Hg,

INTRODUCCIÓN
Las drogas antirretrovirales se utilizan en muchas enfermedades, especialmente en el tratamiento del VIH, y también se han usado en la hepatitis crónica, gripes de distinto tipo, etc.

Debido a los buenos resultados obtenidos en la determinación por este método en algunas bases tales como Adenina, Guanina, Timina, Citosina y otras como la Xantina y la hipoxantina, así como en la determinación de DNA y ATP2-9, nos llevó a tratar de establecer una metodología para la determinación de drogas antirretrovirales nucleosídicas y no nucleosídicas utilizadas en el tratamiento del VIH y otros virus como el del gripe H1N1.

Fueron seleccionadas las siguientes drogas: Efavirenz, Didanosina, Nevirapina, Zidovudina, Lamivudina y Aciclovir antirretroviral del VIH, por el hecho que son producidas en Brasil a relativamente bajo costo, lo que permite a nuestros países suministrarlas casi o completamente gratis a los portadores del VIH. Se decidió incluir también el Oseltamivir pues se usaba en el tratamiento de la influenza tipo H1N1, y en ese momento se estaba aplicando con éxito en Cuba y otros países, hasta la aparición de la vacuna.

Efavirenz10
Esta droga conocida también con los nombres comerciales de SustivaTM y StocrinTM, es un inhibidor de la transcriptasa reversa del tipo no nucleosídico (NNRTI). Y es usada como parte del tratamiento intensivo de personas portadoras del virus y también como parte de algunos tratamientos preventivos.

Didanosina11
En un inhibidor de transcriptasa reversa del tipo nucleosídico, aunque es análogo a la adenosina, no posee en su constitución ninguna de las bases regulares sino una hipoxantina combinada con el ciclo de carbohidrato (ciclo del azúcar). Esta droga es fosforada al metabolito activo del trifosfato de dideoxiadenosina (ddATP) por las enzimas.

Nevirapina12
Es un inhibidor de la transcriptasa reversa del tipo no nucleosídico (NNRTI). Pero no es eficiente en el tratamiento del VIH-2

Zidovudina13
En un inhibidor de la transcriptasa reversa del tipo nucleosídico NTRI, conocida como azidotimidina AZD o ZDV, y con los nombres comerciales de Retrovir y Retrovis y forma parte de algunos productos comerciales conocidos bajo los nombres de Combivir y Tresivir.

Lamivudina14
Esta es también un inhibidos de la transcriptasa reversa del tipo retroviral nucleosídico (NTRI), es un análogo de la citidina y puede inhibir ambos tipos de transcritas 1 y 2. Antes de tornarse activa se debe convertir en trifosfato, inhibiendo también la polimerasa del DNA celular. Ha sido utilizada en el tratamiento de la hepatitis crónica B, a menores dosis que para el VIH, pero el uso prolongado causa la resistencia del virus a este antirretroviral.

Aciclovir15
Es un análogo de la droga antiviral guanosina, comercialmente conocido con los nombres de Cyclovir, Zovirax, y otros. Es una de las drogas antivirales más conocidas principalmente para el tratamiento del Herpes Simplex (HSV) como para el Herpes Zoster. El Aciclovir es visto como el iniciador de una nueva terapia antivirus, por su alta selectividad y baja toxicidad; difiere de otros nucleosídicos en que sólo contiene una estructura nucleosidica parcial, el anillo de azúcar es reemplazado por una estructura de cadena abierta El tratamiento con esta droga, para pacientes portadores VIH y HSV altera el ritmo de la enfermedad y decrece la carga viral de HIV, lo que se atribuye al efecto indirecto de la supresión del HSV en la reproducción del VIH.

Oseltamivir16
También conocido con el nombre comercial de Tamiflu, y fue el primer inhibidor oral de la neuroaminidasa desarrollado comercialmente. Se ha usado en el tratamiento de varios tipos de influenzas A, B, y H1N1. El Interés en esta droga es porque en el momento de iniciar este estudio se estaba empleando en Cuba en los pacientes sospechosos de ser portadores de H1N1, con buenos resultados.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Al observar que las drogas antirretrovirales eran administradas a los pacientes, generalmente en forma de cápsulas o tabletas con cubierta entérica, hizo suponer que las mismas se solubilizan en el intestino, por tanto en medio alcalino. Debido a esta deducción preparamos las soluciones madre de todas ellas en solución de NaOH, disolviéndose completamente, y para asegurar que la disolución fuese completa, en algunas de ellas, se añadió 1% V/V de alcohol etílico. Esta adición no fue necesaria en los casos del Aciclovir ni de la Lamivudina.

Como electrodo de trabajo se empleó el de película de mercurio sobre carbón vítreo, preparado depositando la película durante 300 s a -0,9V, usando como solución 10-3 mol/L de nitrato de mercurio II y electrólito soporte solución de KNO3 10-2 mol/L, debido a los magníficos resultados obtenidos por los autores, en la determinación de numerosos compuestos orgánicos Es significativo que el mismo film puede ser usado para numerosas mediciones sin que experimente deterioro o envenenamiento. Lo cual se explica porque siempre se trabaja a potenciales negativos en medio alcalino, y empleando siempre un potencial condicional de -0,9V durante 60 s. En estas condiciones de pH el potencial de oxidación del mercurio se encuentra a potenciales positivos (aproximadamente +0,1V). Este electrodo fue utilizado en todas las determinaciones que se reportan

En cada una de las drogas se analizaron las posibles interferencia de siete metales, 4 necesarios para la vida (Cu, Fe, Co, Zn) dos reconocidos tóxicos (Pb y Cd) y uno de posible toxicidad genética (Ni). También la interferencia de DNA, ATP y de las restantes drogas antirretrovirales sobre cada una de ellas.

Se estudió el pH óptimo para la determinación por lo que se escogió el superior a 11, donde se obtenían los mejores resultados y lo cual se garantizaba con el electrólito soporte de NaOH 2/10-3 mol/L. Este electrólito se empleó también en todas las determinaciones.

En todos los casos se trabajó en atmósfera inerte, es decir libre de oxígeno. La purga en la primera medición requiere de 8 minutos de flujo de N2, y en subsiguientes solamente 60 s.

El objetivo de esta comunicación no es reproducir cada trabajo, ya que ellos pueden se consultados en las revistas donde han sido publicados o donde lo sean, debido a ello aquí sólo diremos las condiciones óptimas para la determinación de cada uno de ellos.

Efavirenz
Condiciones óptimas para su determinación

Para un tiempo de acumulación de 10 minutos se halló un límite de detección de 1 ppb (3.10-9 mol/L).

Didanosina
Condiciones óptimas para su determinación

Nota: El resto de los parámetros igual a Efavirenz
Para un tiempo de acumulación de 7 minutos se halló un límite de detección de 0,43 ppb (1.10-9 mol/L.

Nevirapina
Las condiciones óptimas para su determinación son las mismas que para la didanosina excepto el intervalo de concentración, que en este caso es 0,01-0,14 ppm y el tiempo de acumulación que es de 120 s.
Para un tiempo de acumulación de 6 minutos el límite de detección es de 3.10-9 mol/L.

Zidovudina
Condiciones óptimas para su determinación

Nota: El resto de los parámetros como en la Nevirapina
El límite de detección hallado, para un tiempo de acumulación de 5 minutos, es de 0,67 ppb (2,5.10-9 mol/L).

Lamivudina
Las condiciones óptimas para su determinación son iguales a la Nevirapina excepto el potencia inicial y de acumulación que es de -0,40V, el potencial final de -1,20V y el tiempo de acumulación de 90 s.
El límite de detección, para 4 minutos de acumulación es de 0,13 ppb (5,7.10-10 mol/L).

Aciclovir
Las condiciones óptimas para su determinación son iguales a la Lamivudina excepto el intervalo de concentración que es –0,02- 0,12 ppm.
El límite de detección alcanzado, para un tiempo de acumulación de 4 minutos, es 0,42 ppb (1.10-9 mol/L).

Oseltamivir
Excepto el intervalo de concentración 0,0 - 0,5 ppm y el pH entre 7-8 todos los demás parámetros son iguales a la Lamivudina.
El límite de detección que se encontró para un tiempo de acumulación de 15 minutos es de 1,66 ppb (5,3.10-9 mol/L).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Figura 1 muestra el voltamograma “adsortivo stripping” cíclico lineal.


Figura 1. Voltamogramas cíclicos stripping adsortivos de lãs drogas antirretrovirales (50µL). A) Efavirenz, B) Didanosina y Nevirapina, C) Zidovudina y D) Aciclovir y Lamivudina de una muestra sintética de todas las drogas (10 ppm de cada una) en 10 mL de una solución 2.10-3 de NaOH. Tiempo de acumulación 300s a A)-0,05V, B) -0,2V, C) -0,3V y D) 0,4V. Tiempo condicional 60s a -0,9V. Velocidad de barrido 50 mV/s. Potencial Final -1,0V.
 
De la figura 1 de aprecia que el potencial de acumulación varía para cada droga, mientras el Efavirenz requiere -0,1V, la Didanosina y Nevirapina requiere -0,2V, la zidovudina -0,3V y la Lamivudina y el Aciclovir -0,4V. En ese mismo orden cada vez se requiere menor tiempo de acumulación.

La Figura 2 nos muestra el voltamograma adsortivo stripping cíclico lineal del Oseltamivir.


Figura 2. A) Oseltamivir; Etil-(3R-4R-5S)-5amino-4acetoamido-3-(pentano-3-yloxi)ciclohexano-1-ene-1-carboxilato. B) Voltamograma cíclico lineal adsortivo de 10 ppm de Oseltamivir en solución de NaOH (pH 7-8), tiempo condicional 60s a -0,9V; tiempo de acumulación 240s a -0,10V con agitación; velocidad de barrido 100 mV/s; electrodo de película de Hg, Referencia Ag/AgCl y auxiliar Pt.

Esta droga para su determinación requiere un pH menos alcalino que los antirretrovirales de VIH.

Otro hecho común es que las mejores señales de corrientes y la forma más definida del pico se obtienen con la voltametría cíclica DC. En esta voltametría los máximos aparecen en el barrido hacia potenciales más negativos, sin embargo en el barrido inverso no aparece máximo en ningún caso. La excepción la constituye el Efavirenz que requiere el empleo de un barrido diferencial de pulso para obtener picos bien definidos.

Las ausencia de grupos amina en la molécula conduce a picos menores, y menos estrechos, con una señal también menor (Nevirapina y Didanosina), en el caso del efavirenz la presencia de 3F en el mismo carbono parece tener influencia negativa en las magnitudes del pico.

Lo referido en el párrafo anterior se deduce de la figura 1 donde se agrupan las seis droga antirretrovirales, contra el VIH, estudiadas en las mismas condiciones experimentales.

CONCLUSIONES
Los mejores señales de corriente y la forma más definida del pico se obtienen con la voltametría adsortiva stripping con barrido cíclico DC. En esta voltametría los máximos aparecen en el barrido hacia potenciales más negativos, sin embargo en el barrido inverso no aparece máximo en ningún caso. La excepción la constituye el Efavirenz que requiere el empleo de un barrido diferencial de pulso para obtener picos bien definidos

Es interesante el fenómeno de que los picos más estrechos y definidos, y la mayor señal de corriente parece estar asociada a la presencia de grupos –NH2 (Lamivudina y Aciclovir), cuando el grupo es =NH, el pico es más ancho y muestra una menor señal analítica (Zidovudina), aunque en esta droga también ocurre una reducción del grupo azida17.

Las ausencia de grupos amina en la molécula conduce a picos menores, y menos estrechos, con una señal también menor (Nevirapina y Didanosina), aunque haya presencia de nitrógeno en la estructura, en el caso del efavirenz la presencia de 3F en el mismo carbono parece tener influencia negativa en las magnitudes del pico.

Se demostró que la reacción electródica es adsortiva, y además acumulativa. La determinación es muy favorecida por el empleo de un electrólito simple y muy diluido, conveniente para la determinación de trazas.

Los límites de detección se realizaron a diferentes tiempos de acumulación para cada una, y los valores rondan 10-9-10-10 mol/L, pero lo interesante es que el tiempo de acumulación empleado va siendo cada vez menor en el siguiente orden Oseltamivir (15 min) Efavirenz (10 min.), Didanosina (7 min.), Zidovudina (6 min.) Nevirapina (5 min.) y Lamivudina y Aciclovir (4 min.)

AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al CAPES-Brasil y MES-Cuba por su apoyo en este trabajo y también a la Dra. Katia Cristina Leandro de la Fundación Oswaldo Cruz por el suministro de las muestras de drogas.

REFERENCIAS
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Enviado por Arnaldo Aguiar Castro; Percio Augusto Mardini Farias
Contactar mailto:pfarias@puc-rio.br

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Publicado Thursday 23 de June de 2011