Dentro del grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno, se encuentra Azotobacter chroococcum, la cual es una de las más estudiadas [1]. A pesar de las propiedades que esta posee como fijadora de nitrógeno, la proporción en que se encuentra en la rizosfera de las plantas no es lo suficiente para efectuar su acción benéfica a las plantas [2]. Por esta razón y en vistas a incrementar los cultivos nacionales y el enriquecimiento de nuestros suelos, se realizó en Nicaragua en la Universidad Nacional de Ingeniería (UNI), investigaciones sobre esta bacteria en cuanto a: Aislamiento y purificación de la especie bacteriana [3], Selección del medio de fermentación y Formulación del medio de fermentación con melaza nacional, utilizando para ello técnicas microbiológicas tradicionales, (algunas de ellas modificadas y adaptadas a la especie chroococcum), además, los principios básicos de fermentación bacteriana [4, 5]. En cada una de estas etapas se utilizó como patrón la cepa ATCC (American Type Culture Collection) 9043, cultivo puro de Azotobacter chroococcum de clima trópical. Todo lo anterior con el objetivo de determinar las mejores condiciones para la producción del biofertilizante apartir de

Azotobacter chroococcum, a escala de banco de laboratorio. El aislamiento y purificación [6] se llevó a cabo utilizando el método de Winogradsky [1] aprovechando los suelos sembrados con Tempate de la Universidad Nacional de Ingeniería UNI-Simón Bolívar y Recinto Universitario Pedro Arauz Palacios (UNI-RUPAP), pues estos habían sido inoculado con BIOSTIN-1, biopreparado a base de Azotobacter chroococcum y otras bacterias del suelo, traído de la Academia de Ciencias de la Habana, Cuba. Se lograron aislar dos cepas bacterianas nativas V y XX [2] las cuales se desarrollaron en medio natural melaza y en medio sintético 77 de Fred y Waksman modificado, dando un aporte científico-técnico al país, al presentar una alternativa biológica confiable, como lo es un fertilizante natural obtenido de nuestros suelos, y económica puesto que se logró reducir el costo de formulación del medio de fermentación modificado. [6]. Hasta aquí, se contaba con dos cepas nacionales de Azotobacter chroococcum, a las cuales era necesario determinarles la eficiencia como fijadoras de nitrógeno y productoras de sustancias fisiológicamente activas que estimulan el desarrollo de las plantas para su posible utilización como biofertilizante, de lo cual dependerá su producción a gran escala. Dadas las propiedades que como bacteria fijadora de nitrógeno [7], contiene Azotobacter chroococcum en cuanto a estimular la germinación de semillas y acelerar el desarrollo de algunas especies vegetales, nuestro propósito es aplicar el biofertilizante preparado a partir de Azotobacter chroococcum, tanto en fase vivero, como en plantación y fructificación del tempate y el tomate, ya que dentro del proyecto de investigación Austríaco *BIOMASA* de la Universidad Nacional de Ingeniería (UNI), se está llevando a cabo investigaciones sobre el aprovechamiento de la semilla de tempate para extraer aceite de la misma y utilizarlo como un sustituto del Diesel [8]. Con fines de comprobar la eficiencia de las cepas aisladas, se pretende en el presente trabajo realizar ensayos a nivel de campo en cultivos de tempate y tomate, aplicando el biopreparado en medio líquido a base de cada una de las cepas aisladas, tomando como patrón ATCC 9043. A su vez se pretende presentar una propuesta de planta piloto para la producción del biofertilizante a base de Azotobacter chroococcum. Haciendo uso para esto de una estrategia particular del escalado que es ejecutada para mantener un parámetro constante desde el laboratorio hasta el escalado de una planta de fermentación [9 – 10].

Para la inoculación del campo con el biopreparado a base de Azotobacter chroococcum se produjeron en el laboratorio las cepas ATCC, V y XX (no menos de 1 litro por cepas); para esto la parte agrícola preparo el área de siembra, limpieza del área, trazado de las dimensiones en el campo, poda de los árboles y preparación del material vegetativo. Para garantizar el cumplimiento de lo antes descrito y obtener resultados cuantitativos, se tomaron en cuenta los siguientes procedimientos y técnicas [11].

Reactivación de cepas bacterianas: Para reactivar la bacteria se utilizó el medio de cultivo 77 de Fred y Waksman modificado sólido. El medio de cultivo se vierte en placas Petri y tubos de ensayos aproximadamente 10 ml, luego de esto se procede a sembrar las cepas (ATCC, V y XX), en condiciones de esterilidad. Colocar las placas y los tubos en una incubadora a 37 ⁰C por un día [2]. Luego de esto se prepara el pre-inóculo en medio líquido de cada una de las cepas, para ser puesta en shaker durante 12 horas (se detiene el proceso en fase exponencial), para luego preparar el inóculo [6].
Preparación del inóculo. Para la preparación del inóculo, este debe cumplir con los siguientes requisitos: El cultivo puro debe ser metabólicamente activo y libre de contaminantes. El inóculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo después de cada división celular). Se debe disponer de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen de medio líquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3-10 % del volumen total a fermentar [12]. Dentro del desarrollo y crecimiento de cada cepa bacteriana (V, XX y ATCC 9043), en las proporciones requeridas para aplicar al campo (1 litro por cada cepa) utilizando como pre-inóculo el obtenido en el paso anterior, se procuró obtener los inóculos en su fase exponencial [9-13-14], con una concentración de biomasa del orden 10⁸-10⁹ células/ml [15]. En las aplicaciones posteriores en el campo para la preparación del inóculo se utilizó como medio nutritivo melaza nacional de AGROINSA (Agroindustrial Azúcarero, S.A)

Clarificación de la melaza: De la miel traída de AGROINSA se diluyeron 4 litros de melaza con 1 litro de agua (el grado de dilución deberá ser definido acorde con, los resultados que se obtengan de una prueba analítica para definir concentración de azúcares reductores en la miel final, una vez que ha sido clarificada), para clarificar a una temperatura de 85 ⁰C usando como medio de calentamiento agua destilada a una temperatura de 100 ⁰C. Luego de alcanzar la melaza 85 ⁰C se deja por 3 horas más en el termostato. Al finalizar esto se lleva a la cámara de flujo laminar con flujo vertical para evitar contaminación [16]. Para determinar la cantidad de azúcar reductor, se utilizo el Método volumétrico de Lane y Eynon.[17 – 18]

Técnicas microbiológicas. Transferencia de colonias seleccionadas [19], Prueba de quiste [20], Tinción de gram [21]. Prueba de cápsula [20].

Prueba de germinacion de semillas de tomate. El experimento se llevo a cabo en el laboratorio de biotecnología el cual consistió en determinar el porcentaje de germinación de semillas de tomate (Variedad HYPEEI 108) aplicando el biofertilizante preparado con cada una de las cepas (Cepa V, Cepa XX, ATCC) y tomando como testigo material fertilizado (MF) y material no fertilizado (MNF) utilizando la técnica de bandejas de la industria Naturas (Nandaime). Se procedió de la siguiente manera: Se utilizaron tres bandejas. Cada bandeja tiene la capacidad de 200 plántulas. Se siembra de una o dos semillas por cada celda, se riega periódicamente de acuerdo con las exigencias de humedad y se espera el tiempo requerido para la germinación de las semillas. [11]

Apartir de un inóculo de 50 ml de cada cepa preparado con el medio líquido de 77 de Fred y Waksman modificado, se hicieron una serie de diluciones celulares (10^-1, 10^-2 hasta 10^-8) [11]. A cada una de estas diluciones se les midió absorbancia a longitud de onda 750 nm. Y para conocer las unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) se aplicó el método de conteo de colonias [22], utilizando el medio de cultivo Ashby modificado [23] con estas mediciones se construyó la curva de calibración. Para la curva de crecimiento, posteriormente se preparó un pre-inóculo de 50 ml con medio natural melaza de cada cepa. Para garantizar el obtener inóculos en su fase exponencial se determinó cada hora las UFC/ml a la misma longitud de onda contando para ello con la curva de calibración, cada una de estas mediciones se introdujo a la curva de calibración, y a partir de los valores obtenidos se construyó la curva cinética UFC/ml vs tiempo (Fig. 4). A partir del inóculo de 50 ml preparado con medio natural melaza para cada una de las cepas, se inóculo un volumen efectivo de 500 ml. Para obtener la curva cinética UFC/ml vs tiempo de esté inóculo se procedió de igual forma [11].

Viabilidad del biopreparado en condiciones de laboratorio. Para determinar la viabilidad se hizo un inóculo de 50 ml de cada cepa con el medio líquido 77 de Fred y Waksman modificado. Almacenándose en refrigeración a una temperatura de 4-10 ^oC y observándose cada tres días muestras en el microscopio conservadolas bajo condiciones lo más higiénicas posible para evitar contaminación [11, 15, 24] (Cuadro No 1)

Propuesta del proceso tecnológico de biofertilizante a nivel de planta piloto. La materia prima básica para la producción del biofertilizante son las cepas nacionales de Azotobacter chroococcum. La materia prima secundaria utilizada como nutriente es la miel final de caña de 93.86^oBrix aproximadamente, con una viscosidad de 45,000 cp (Kg/m s) y un contenido de azucares reductores de 43.33 % [25]. Esta miel es sometida a un tratamiento previo (clarificación) antes de su utilización en los fermentadores [26]. Antes de iniciar la fermentación los fermentadores se esterilizan hasta una temperaruta de 95 ^oC enfriándose luego a 35 ^oC. Están equipados con un panel de control con el cual se regulará el oxígeno, el pH, la temperatura, el antiespumante (aceite vegetal), el nivel de líquido y el flujo de aire [27]. El proceso de fermentación es en serie; una línea de 2 fermentadores, que equivalen a la capacidad de la planta de biofertilizante [28]. Para iniciar la fermentación se prepara el primer fermentador de 50 litros el cual es inoculado con el pre-inóculo de cultivo puro preparado en el laboratorio y se comienza una fermentación discontinua (batch). La fermentación se da por terminada en el momento que alcanza el tiempo exponencial (aproximadamente 3 horas) y pasa al siguiente fermentador (500 l), durante la fermentación no se hace nuevas adiciones de melaza. El concentrado es extraído del último fermentador y pasa a un contenedor, posteriormente el producto se envasa en recipientes estériles y luego estos se almacenan en la cámara de frío la que garantiza un intervalo de temperatura de 4 - 10 ⁰C, evitando en todo momento la congelación y ésta mantendrá a su vez los requisitos higiénicos-sanitarios establecidos [24].(Fig 1)

Fig. 2 Diagrama del diseño Propuesto de la planta piloto

Consideramos las distintas agrupaciones de equipo tecnológicos o secciones que conforman una instalación completa que están divididas de la siguiente manera. [29] Almacenamiento y preparación de melaza, Preparación del pre-inóculo, Fermentación, [30,31]. Almacenamiento del producto, Laboratorio de control de calidad. Suministro de energía eléctrica, Suministro de agua para uso industrial, Refrigeración y circuitos de enfriamiento, Almacenamiento, Estación de aire para fermentación, Estación de limpieza y desinfección, Taller de mantenimiento, Sistema contra incendio [26]. La estación comprende: Dos fermentadores piloto tipo Air-lift de capacidad (0.05 m³ y 0.5 m³). [22, 32]. Un tanque con capacidad 4 m³ para almacenar melaza cruda durante 1 mes, con bomba dosificadora de acero inoxidable que permite conocer la capacidad de la melaza que se va a utilizar. Un tanque pesa de 2 m³ para melaza prediluida. Un tanque intermedio para dilución y precalentamiento de melaza. Dos clarificadores, una para clarificar la melaza y la otra para recuperar los fangos. Un intercambiador de placas para enfriamiento de la melaza. Un tanque para almacenar melaza preparada de 2 m³. Cuatro bombas de acero inoxidable. Un contenedor de 0.4 m³. Nueve válvulas manuales de acero inoxidable para la instalación de las tuberías entre los fermentadores y el tanque de melaza preparada. Un armario de distribución eléctrica con arrancadores y acumuladores (Fig. 2)

Resultados
Cultivos de tomate. El ensayo se dividió en dos fases: Fase semillero y fase de plantación final, aquí se utilizó un diseño completo aleatorizado con cinco tratamientos y tres réplicas y las variables medidas fueron: Altura, grosor, número de hojas, número de flores, número de frutos y peso del fruto. Para todo el experimento se pudo observar un predominio de la cepa V en el caso de este cultivo. En los semilleros inoculados con la bacteria se obtuvo una aceleración de la germinación de 4 a 6 días. En el transplante definitivo se observó una aceleración de la fase de floración y se obtuvo un incremento en la productividad total alcanzada obteniéndose el mayor porcentaje de frutos en plantas inoculadas con la cepa V que fue del 75% de incremento con respecto a las demás variantes. (Fig. 3 A)

Para cultivos de tempate. Se efectuó el ensayo en 45 plantas de 1 año de edad y las variables medidas fueron: Número de rebrotes (relación ramal/apical), número de nuevas inflorescencias (relación hembra/macho), número de infrutos, número de frutos, número de abortos y peso del fruto (por planta). Obteniéndose los mejores resultados con la cepa XX ya que esta presentó el mayor número de rebrotes por planta, el mayor número de inflorescencias y el mayor rendimiento en frutos por planta que fue del 31.5 % de incremento con respecto a las demás variantes. (Fig. 3B)

Fig. 3.Rendimiento porcentual de la cosecha de tomate [A] y tempate [B]; Al evaluar el Biofertilizante a base de Azotobacter chroococcum en comparación con el testigo [fertilizante químico, Agua ].

Cuadro No 1 Determinación de la viabilidad

Una vez que se conoció la cinética (Fig. 4) y comprobada la superioridad del medio natural (melaza), que permitió obtener poblaciones de la bacteria del orden 10¹⁰ células/ml del medio en condiciones de laboratorio, el máximo valor que puede obtenerse de acuerdo con el volumen de la célula bacteriana, cien veces superior a la que se obtiene con los medios reconocidos internacionalmente, necesitando un tiempo menor de fermentación es posible el desarrollo del proceso de escalado de la producción a volúmenes superiores a los producidos en el laboratorio [32]. En vista a la aplicación tecnológica (Industrial) de las capacidades de los microorganismos y la preservación del medio ambiente, los procesos biológicos los cuales se obtienen por fermentaciones microbianas (en nuestro caso fermentación aerobia) han alcanzado un amplio desarrollo en la agricultura especialmente las bacterias nitrificantes no simbióticas [10]. Mediante aportes recientes de la ingeniería utilizando estrategias de escalado se pueden obtener mayores volúmenes de producción de biopreparados utilizando biorreactores a diferentes escalas de trabajo [33]. En nuestro caso para producir mayor volumen de biofertilizante se tuvo que reproducir y ajustar los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio al tamaño natural de la planta piloto [29, 31]. (Fig. 1)

Definición del producto: El producto principal a obtener es el biopreparado a base de Azotobacter chroococcum con una concentración de biomasa del orden 10¹⁰ células/ml que será empleado como biofertilizante para sustituir los fertilizantes químicos, el biofertilizante está caracterizado como un bien de consumo final duradero, ya que su vida útil no se extingue a medida que se utiliza en los cultivos agrícolas ya que las bacterias contenidas en el inoculante se establecen y se multiplican en el suelo para formar poblaciones suficientemente elevadas, capaces de producir una concentración de sustancias fisiológicamente activas que permita su utilización por las plantas y recíprocamente la bacteria en el suelo se alimente de las sustancias nutritivas que le suministra la planta a través de las secreciones radicales (15-24). Este biofertilizante ha sido probado en otros países, presentando mayor rendimiento que los fertilizantes químicos con las ventajas que este producto no contamina el ambiente y además su proceso es sencillo, lo que resulta un beneficio adicional para el país (15). En nuestro caso partimos de proponer una planta piloto que tiene la capacidad de producción de 133 m³/año, la cual durante el primer año la producción será del 60 % que equivale al 79.8 m³ destinándose el 20 % para otros cultivos. (Cuadro N^o 2)

Cuadro No 2 Capacidad de la planta

Discusión.
Al evaluar los parámetros de campo para el cultivo del tomate, los resultados obtenidos en el semillero mostraron una germinación precoz de 4 a 6 días para el caso de las réplicas en las que se utilizó el biopreparado, mientras que con fertilizante químico y testigo (sin utilizar nada más que agua) la germinación normal fue de 8 días. El efecto estimulador sobre la germinación se atribuye a la alta concentración de sustancias fisiológicamente activas producidas por la elevada biomasa bacteriana en el medio de cultivo [15, 33] Nuestros resultados indican la posibilidad de acortar el periodo que transcurre entre la fase de semillero y el momento en que las plantas están listas para el transplante definitivo, ya que el desarrollo es más rápido y se alcanzan las características requeridas para que puedan ser transplantadas en un tiempo menor, lo que se traduce en ahorro de agua, plaguicida y mano de obra [15, 33, 34]. Al culminar el periodo del semillero, en el momento del transplante, la tierra húmeda del semillero se adhiere a las raíces y es llevada de esta manera al campo transplantado, con ésta tierra se trasladan elevadas poblaciones de Azotobacter chroococcum desarrolladas a partir de la inoculación inicial del semillero. Es decir que la acción de las bacterias no se limita al semillero, sino que continua después del transplante produciendo sustancias que actúan sobre la floración, fructificación, rendimiento total y calidad de los frutos producidos, por lo que teóricamente se plantea que desde el momento del trasplante (si se hace adecuadamente), existe en el sistema radicular de las plántulas una densidad poblacional de microorganismos que se considera adecuada [15, 33] De manera general se pudo observar que los frutos obtenidos mediante la inoculación con la cepa V, resultaron ser frutos con mayor peso y mejor apariencia. Los demás tratamientos se comportan de manera muy similares entre si en cuanto al control de peso y apariencia. (Fig. 3 A)

Es importante destacar que en trabajos previos [6] se había determinado el tiempo de producción en alrededor de 8 horas, pero esto era factible siempre que el proceso de preparación del pre-inóculo se hiciera en medio líquido y partiendo de una azada de bacterias, pero en nuestro caso el proceso se desarrolla en medio sólido a partir de cuñas. Esta sencilla modificación representa una reducción de alrededor de 10 horas en el proceso productivo y puede sustentarse en el hecho de que estamos partiendo de un mayor número de microorganismos que se encuentran en condiciones de crecimiento acelerado (fase exponencial) por lo que la fase lag (fase de crecimiento lento y adaptación al medio) [13] se hace mucho más corta. Al conocer la cinética
del crecimiento bacterial (Fig. 4), se preparó un preinoculo el cual se sometió a prueba de envejecimiento durante todo el periodo de investigación y se logró conocer que el biopreparado permanece en refrigeración hasta más de cuatro meses, siempre y cuando se mantenga bajo condiciones adecuadas de temperatura (entre 4-9 ^oC), condiciones lo más higiénicas posibles y siempre que se evite que el medio llegue a secarse por completo. El mantenimiento de estas condiciones garantiza un cultivo viable y sin contaminación apreciable. [11]. Durante todo el lapso de observación se tomaron muestras cada tres días para ver la viabilidad del cultivo, durante los tres meses no se presentaron indicios de contaminación sino que al cumplir el cuarto mes observamos presencia de contaminación de levaduras (S.cerevisiae) en los inóculos preparados con las cepas XX y ATCC. La norma cubana permite la presencia de levaduras en un intervalo de 10 a 12 cel/ campo [24] Para la conservación del cultivo por períodos de hasta seis meses es importante que el mismo se encuentre siempre bajo condiciones reguladas de temperatura (entre 4-10 ⁰ C), temperaturas superiores a este intervalo provocan que se pueda continuar con la multiplicación de los microorganismos a velocidades mayores y esto en el tiempo repercute en el agotamiento del sustrato, por lo que finalmente se podría empezar a producir lisis bacterial por déficit de nutrientes. Otra situación podría provocarse si la temperatura se incrementase por encima de los 37 ⁰ C, en esta condición el fenómeno de lisis y muerte bacterial se acelera y por ende la vida útil del biopreparado podría verse disminuida hasta por el orden de las 24 horas o menos. Temperaturas muy bajas e incluso temperaturas de liofilización provocan efectos similares en esta bacteria que los que se provocan en otros microorganismos, o sea aunque se incremente el tiempo en que es factible conservar el cultivo celular es importante considerar reducciones en la viabilidad hasta del orden del 50% de los microorganismos. Otros aspectos de interés a considerar en la conservación de los cultivos es que los mismos conserven, condiciones de humedad requerida e higiene que les evite la contaminación externa que haga que por competencia por el sustrato se acelere la muerte bacterial [11] (Cuadro No 1)

Mediante aportes recientes de la ingeniería utilizando estrategias de escalado se pueden obtener mayores volúmenes de producción de biopreparados utilizando biorreactores a diferentes escala de trabajo [34]. Para producir mayor volumen de biofertilizante se tuvo que reproducir y ajustar los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio esto posibilito escalar el volumen al tamaño natural de la planta piloto.[28, 36, 37].

En estudios anteriores realizados en otros países se recomienda aplicar 0.01 m³ de biofertilizante concentrado por hectárea en relación con el agua de 1:20 [33]. Este dato se tomo como referencias para poder escalar el volumen necesario para suplir las hectáreas de cultivo de tomate y tempate sembradas en el país teniendo en cuenta siempre en cada etapa escalada el 10% en volumen equivalente al factor de escala 10 que se encuentra dentro del rango (5-15) que permite escalar el volumen de trabajo de laboratorio al volumen de escala de planta piloto [38]. En nuestro caso partimos de proponer una planta piloto que tiene la capacidad de producción de 133 m³/año, la cual durante el primer año la producción será del 60% que equivale al 79.8 m³ destinándose el 20% para otros cultivos. Esta planta durante los primeros dos años producirá cantidades variables manteniéndose estable a partir del año tres trabajando al 100% de su capacidad el resto de su vida útil. Por otro lado para determinar el precio de venta de un litro de biofertilizante, nos basamos en la producción diaria de la planta (317 l/día) y se totalizaron los costos de operación resultando que un litro de biofertilizante se comercializará a 1.63 $/l con un margen de ganancia del 40% sobre el costo del producto [39, 40].(Cuadro N^o 3) (Fig. 2)

Cuadro No 3 Costos totales de operación para producir 317 l/día de biofertilizante

.

El conocer los ingresos por ventas y los costos financieros facilitaron calcular el punto de equilibrio que resultó ser de 55.90 m³/año logrando conocer la producción mínima de la planta piloto para no incurrir en perdidas. Al analizar el estado de resultado permitió conocer que el proyecto es rentable desde el primer año de operación de la planta piloto.

Resumen
Los biofertilizantes (biopreparados) a base de Azotobacter chroococcum para su aplicación a los cultivos agrícolas se presentan como una suspensión de cultivo de esta bacteria, caracterizada por una super población de células obtenidas por fermentación de cepas correctamente seleccionadas. La aplicación agrícola a escala comercial de estos biopreparados, representa enormes beneficios para el ambiente dado que se disminuye la aplicación de químicos y se devuelve paulatinamente al suelo a sus condiciones naturales originales. En este trabajo se comprobó a nivel de campo la acción fijadora de nitrógeno de las cepas nacionales de Azotobacter chroococcum (Cepa V y Cepa XX) tomando como patrón la cepa ATCC 9043, cultivo puro de Azotobacter chroococcum de clima trópical de la American Type Culture Collection (cepario de Maryeland, Estados Unidos) y se escaló a nivel de planta piloto el proceso de producción de biofertilizante a base de Azotobacter chroococcum utilizando como medio nutritivo melaza nacional. Está investigación se realizó en tres fases experimentales que son: Evaluación de cepas de Azotobacter chroococcum en campos experimentales de Tomate y Tempate, obteniéndose el mayor porcentaje en frutos en plantas de tomate inoculadas con la cepa v, con respecto al cultivo del tempate se obtuvo el mayor rendimiento en frutos en las plantas inoculadas con la cepa xx. En la segunda fase se determino la viabilidad del biopreparado en condiciones controladas de laboratorio y se logro conocer que permanece viable en refrigeración hasta mas de cuatro meses. Para la ultima fase se da la Propuesta del diseño de una planta piloto para la producción de biofertilizante a partir de Azotobacter chroococcum donde se analizo la evaluación financiera permitiendo conocer que el proyecto es rentable desde el primer año de operación
Palabras claves: Biofertilizante; Biopreparado; Fijación de nitrógeno; Azotobacter chroococcum; Escalado.