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Bioensayos de toxicidad aguda en neonatos de Moina macrocopa (Straus, 1820) (Crustacea: branchiopoda) expuestos a soluciones de hidroxido de sodio (NaOH)
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Enviado por César Augusto Mac-Quhae
Código ISPN de la Publicación: EpZZpVZZuFbyWksYOX
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| Resumen: Los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el grado de afectacion que una sustancia quimica tiene en organismos vivos y estos pueden ser agudos o cronicos. Las pruebas agudas cuantifican las concentraciones letales de un xenobiotico a una especie en particular.(V) |
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Índice
1. Introducción
2. Materiales y métodos
3. Resultados y discusión
4. Conclusiones
5. Recomendaciones
6. Bibliografía
1. Introducción
Los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el grado de afectación que
una sustancia química tiene en organismos vivos y éstos pueden ser agudos o crónicos.
Las pruebas agudas cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico a
una especie en particular. El valor calculado se denomina concentración letal
media (CL50) y corresponde a la concentración de un xenobiótico que
causa la muerte al 50 % de la población experimental al cabo de un tiempo
determinado, generalmente en 48 o 96 horas. En contraste, las pruebas crónicas
estiman la concentración – efecto media (CE50) de la sustancia de
prueba que causa un efecto al 50 % de la población experimental, al cabo de un
tiempo determinado (Rodríguez y Esclapés, 1995).
Para regular las descargas de aguas residuales tóxicas hay que utilizar datos
de ensayos de toxicidad hechos con organismos vivos y confiar en estos datos,
además de efectuar estudios detallados de las características físicas y químicas
de los contaminantes y de los cambios que ocurren después de su descarga en el
medio. Cuando se puedan describir con precisión en términos químicos y físicos
los componentes tóxicos de un contaminante y se disponga de técnicas analíticas
pertinentes y de suficiente información acerca de la toxicidad de esos
componentes para los organismos acuáticos, se podrán establecer normas para
tales contaminantes en valores numéricos para los componentes tóxicos (FAO,
1981).
Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en organismos vivos bajo
condiciones de laboratorio, se han incrementado en estos últimos tiempos debido
a la brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis letales y
subletales (CL50) que afectan negativamente organismos vivos en los
ambientes marinos, estuarinos y dulceacuícolas (Villamar, 1996).
El uso de bioensayos para la evaluación de toxicidad de sustancias liberadas al
medio a través de efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores
propios de los ambientes evaluados, lo cual favorece indirectamente la
preservación de la biodiversidad local. Sin embargo, la variabilidad en la
aplicación de las técnicas experimentales para el mantenimiento de organismos
silvestres afecta la interpretación y comparación de los resultados entre
laboratorios, por lo que se hace necesario desarrollar metodologías
estandarizadas para establecer condiciones controladas (Palacios y Pereira,
1997). Utilizar organismos provenientes directamente del hábitat natural puede
distorsionar los resultados obtenidos por fuentes de variabilidad no previstas,
como nutrición, dinámica de la población, estrés por depredación, etc.
(Sosnowski et al., 1979). Estas variables pueden ser controladas o eliminadas
con las poblaciones de laboratorio; además, el entrecruzamiento consanguíneo
que ocurre a lo largo del tiempo en esas poblaciones, resulta en una
considerable reducción de la variabilidad genética (Lewontin, 1974).
Por otra parte, a causa de la complejidad del medio ambiente acuático y de las
comunidades biológicas que lo integran es difícil establecer el grado de
deterioro que afecta a las especies o comunidades acuáticas. Por esta razón es
conveniente realizar bioensayos utilizando organismos vivos en condiciones
controladas de laboratorio. Sin embargo, el objetivo primordial de un bioensayo
es reflejar la realidad de cómo afectaría a los organismos vivos en su medio
natural y para ello es recomendable paralelamente investigar continuamente las
comunidades en su propio hábitat (Villamar, 1996).
La captación y utilización de zooplancton como biomonitor data desde comienzos
del siglo XX, hoy en día, gracias al desarrollo de técnicas para su cultivo en
el laboratorio, representa una herramienta que gana cada vez más reconocimiento
en la evaluación ecotoxicológica (Sosnowski et al., 1979; Maciorowski, 1981).
Según Reish y Oshida (1987), para la realización de bioensayos es conveniente
el uso de zooplancton por su pequeña talla; requerimiento de poco espacio de
laboratorio y poco volumen de agua; gran sensibilidad a sustancias tóxicas;
ciclo de vida corto; requerimientos nutricionales generalmente conocidos, lo
cual lo hace ideal para estudios de bioacumulación.
Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los bioensayos de toxicidad
se encuentran los cladóceros, también llamados pulgas de agua, son crustáceos
pequeños que constituyen la mitad de la Clase Branchiopoda (Figura 1). El
caparazón (bivalvo) encierra al tronco, pero no a la cabeza y suele terminar
posteriormente en una espina apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio
mediano, también posee antenas frecuentemente largas y utilizadas en la natación.
Además, presenta de cuatro a seis pares de apéndices troncales y el
potsabdomen esta girado ventralmente hacia delante. La mayoría de estos
organismos son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en agua
dulce (Ruppert y Barnes, 1996).

Figura 1.- Vista general de cladóceros, Daphnia pulex.
Fuente: Microsoft Encarta 2001.
En condiciones favorables se reproducen partenogenéticamente (asexualmente)
(Figura 2) cada tres o cuatro días, siendo la población constituida solamente
por hembras. Si el medio se torna desfavorable se reproducen sexualmente,
apareciendo en la población hembras que producen huevos de resistencia llamados
efipios y machos, los cuales fecundaran estos huevos. Si las condiciones
ambientales vuelven a ser favorables estos efipios darán hembras partenogenéticas
(Tortorelli y Hernández, 1995).

Figura 2.- Reproducción partenogenética, hembra Daphnia sp. con
huevos partenogenéticos
Fuente: UDEC. 2001. http://www.udec.cl/bioensayos/recursos_biologicos.html
Debido a su amplia distribución, su importancia ecológica y su sensibilidad a
ambientes intervenidos, se les considera especies indicadoras de condiciones
ambientales adversas. Además, por ser organismos de fácil mantenimiento bajo
condiciones de laboratorio, normalmente se utilizan en pruebas de toxicidad acuáticas.
En Venezuela existen numerosas especies de cladóceros que habitan los lagos
naturales y artificiales, zonas inundables y charcas temporales (Rodríguez y
Esclapés, 1995). En este sentido, Moina macrocopa (Figura 3) es una especie
cosmopolita, un crustáceo encontrado tanto en agua dulce como salobre, habita
en lugares donde las temperaturas oscilan entre 5 y 30 °C y con un pH del agua
desde neutral hasta ligeramente alcalino (Rodríguez y Esclapés, 1995; Martínez
y Gutiérrez, 1997). Esta especie, como muchas otras de cladóceros, tolera
lugares donde existen abruptas disminuciones en la concentración de oxígeno
disuelto y alcanzan altas densidades en cuerpos de agua con gran cantidad de
materia orgánica (Martínez y Gutiérrez, 1997). Esta especie es de talla
relativamente grande comparada con otras especies presentes en nuestro país, es
fácil de cultivar en el laboratorio, posee alta fecundidad y su ciclo de vida
es de 60 días a 20 °C. Se encuentra en ambientes acuáticos con una dureza
total que excede a los 150 mg/l de CaCO3 (Esclapés, 1999). En
Venezuela ha sido reportada en Valencia, Edo. Carabobo, en el Edo. Aragua y en
la Isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y
Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999).

Figura 3.- Vista general de Moina macrocopa.
Fuente: Lebendfutter-Zuchtansatz. 2001.
Existen numerosos trabajos realizados con cladóceros sometiéndolos a metales
pesados: Pereira y García (1994), Rodríguez y Esclapés (1995), Martínez-Tabche
et al.(1997), Baillieul y Blust (1999), Esclapés (1999). También se han hecho
experiencias utilizando insecticidas como contaminantes: Bergling y Dave (1984),
Gliwicz y Sieniawska (1986), Chu et al. (1997), Dewey y Parker (1998),
demostrando que estos organismos son ampliamente utilizados como bioindicadores.
La empresa Bauxilum, de la Corporación Venezolana de Guayana (C.V.G.), se
encarga de las extracciones de bauxita y de la producción de alúmina,
utilizadas comercialmente para la elaboración de aluminio metálico. El proceso
Bayer (Bayer, 1887), como paso intermedio en la obtención del aluminio, es la
etapa industrial que extrae el óxido de aluminio contenido en la bauxita. Este
proceso genera un residuo o desecho que se conoce como "lodo rojo",
que es una suspensión sólido/líquido, constituida principalmente por 20 - 30
% de sólidos y una solución acuosa cáustica. Los sólidos están constituidos
por una fracción gruesa formada principalmente por arena silícica, y una
fracción muy fina con un alto contenido óxidos de hierro. Además, el lodo
rojo contiene: óxido de aluminio residual, sílice, óxido de titanio y soda cáustica
(NaOH), ésta última disuelta en la fracción líquida, lo cual le da un carácter
alcalino con pH superior a 12 (Manrique y Crespo, 1998).
Los hidróxidos son irritantes oculares y graves irritantes cutáneos; muy
corrosivos para ojos, piel y membranas mucosas (Greenpeace, 2001).
Particularmente el hidróxido de sodio es una sustancia tóxica entre 50 y 500
mg/kg según la clasificación de Nancy - Metz (2002). La DL50 por vía
oral para conejo es de 500 mg/kg. Por otra parte, tiene efectos tóxicos en
peces y plancton como consecuencia del cambio de pH que produce; llegando
incluso a ocasionar la muerte de peces (Merck®, 1999).
En caso de inhalación produce quemaduras de las mucosas. El contacto con la
piel y con los ojos ocasiona quemaduras y hasta perdida de la vista; por ingestión
causa irritación de las mucosas de la boca, la garganta, el esófago y el tubo
digestivo, con peligro de perforación del esófago y el estómago (Nancy -
Metz, 2002).
El hidróxido de sodio es irritante y corrosivo de los tejidos. En biopsias de
piel realizadas a personas voluntarias exponiéndolas a disoluciones de NaOH 1 N
en los brazos de 15 a 180 minutos se observaron cambios progresivos, empezando
con disolución de células en las partes callosas, pasando por edema y llegando
incluso a destrucción total de la epidermis en 60 minutos (UNAM, 1998).
Se han reportados casos de disolución total de cabello, calvicie irreversible y
quemaduras del cuero cabelludo en trabajadores expuestos a disoluciones
concentradas de hidróxido de sodio por varias horas. Las disoluciones de
concentración menor del 0,12 % dañan la piel humana en aproximadamente 1 hora.
Por otro lado, una disolución acuosa al 5 % genera necrosis cuando se aplica en
la piel de conejos por 4 horas (UNAM, 1998).
La CL50-96h de NaOH en peces es 189 mg/l y en organismos acuáticos
la CL50 se encuentra entre 10 – 100 mg/l en 96 h (Merck®,
1999).
C.V.G. Bauxilum deposita su desecho de producción, lodo rojo, en tres lagunas
adyacentes al río Orinoco (Figura 4), Ciudad Guayana, Edo. Bolívar. Este
sistema lagunar fue construido en 1979 con un diseño para 21 años de vida útil.
Debido a que la capacidad del sistema original ya fue agotada, se han hecho
modificaciones para prolongar su vida, como elevaciones de los diques (Figura 5)
y construcción de diques filtrantes (CAVSA, 2001a).

Figura 4.- Vista general de lagunas de lodo rojo.

Figura 5.- Elevaciones de los diques de las lagunas de lodo rojo.
Dichas lagunas actualmente presentan problemas de filtración, debido a falta de
obras de ingeniería que las acondicione a recibir el producto del proceso
(pantallas impermeables) y al gran volumen en ellas depositadas (lodo rojo, agua
de lluvia); permitiendo el paso de este material a otras lagunas naturales o al
río Orinoco. Además en períodos de lluvia por el aumento de volumen en las
lagunas existe la posibilidad que ocurran desbordamientos, aunque nunca ha
sucedido.
El almacenamiento de los lodos rojos constituye un problema de gran magnitud
para la industria del aluminio a nivel mundial (Stinson, 1979). Las bajas
velocidades de sedimentación de los lodos rojos hacen que los embalses
requieran cada vez mayores extensiones de terreno. Por otro lado la soda cáustica
(NaOH) constituye un factor de contaminación ambiental. El rebose inesperado de
un embalse de almacenamiento, debido a condiciones climatológicas, podría
generar la contaminación y muerte de los ríos y afluentes aledaños a la
planta (Manrique y Crespo, 1998). Además, las características tixotrópicas de
los lodos rojos inducen problemas de consolidación, invalidando las áreas o
lechos de embalses para efectos de construcción o reforestación (Nguyen y
Boger, 1983).
El 24 de junio del año 2001 fueron reportadas en la prensa local "Correo
del Caroní" (Pág. A -1) muertes extrañas de peces en la laguna natural
de Cambalache, estado Bolívar, Venezuela. Graffe (2001) estudia la existencia
de filtraciones en el Dique Nº 12 de las lagunas de lodo rojo, el cual se
intercepta con el canal Nº 5 para aguas de escorrentía que culmina en la
laguna natural de Cambalache. Estas filtraciones representan una posible causa
de la mortandad de peces ocurrida en dicha laguna. Las filtraciones están
siendo remediadas temporalmente mediante el uso de bombas que devuelven el
desecho a las lagunas de deposición (Figura 6).

Figura 6.- Bombeo de licor cáustico proveniente de filtraciones
existentes en las lagunas de depósito.
La Dirección Estadal del Ministerio del Ambiente y de los Recursos Naturales
del estado Bolívar, Venezuela, expone el 9 de julio del 2001, en un reporte a
la prensa local "Correo del Caroní" (Pág. D - 1), la necesidad de
realizar experiencias con organismos vivos para determinar si realmente el lodo
rojo fue la causa de muerte de los peces. Es importante señalar que en dicha
zona descargan los desechos de una granja de porcinos, de una fábrica de
bloques y además existe el relleno sanitario municipal Cambalache (Graffe,
2001).
Esta situación es alarmante ya que en dicha zona se encuentran viviendo
aproximadamente 9.500 personas que tienen libre acceso a las lagunas naturales y
de lodo rojo, llegando incluso algunos a pescar y consumir el agua de las
lagunas naturales, como por ejemplo, la laguna de Cambalache.
No se encuentra estipulado en algún decreto o norma de las leyes venezolanas
las concentraciones máximas permisibles de hidróxido de sodio en los vertidos
líquidos.
Objetivo General
Determinar, mediante el uso de bioensayos agudos, el efecto del hidróxido de
sodio (NaOH) principal componente del desecho (lodo rojo) de la empresa C.V.G.
Bauxilum, sobre el cladócero Moina macrocopa.
Los objetivos específicos son:
- Determinar la concentración letal media (CL50) para ejemplares
de Moina macrocopa, sometidos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH)
utilizando agua sintética dura.
- Determinar la concentración letal media (CL50) para ejemplares
de Moina macrocopa, sometidos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH)
utilizando agua del río Orinoco
- Comparar la sensibilidad presentada por los ejemplares de Moina macrocopa,
expuestos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH), en agua sintética
dura y en agua del río Orinoco.
2. Materiales y métodos
Organismo Experimental
Los bioensayos se realizaron con la especie Moina macrocopa (Straus, 1820), la
cual fue colectada del canal de aguas servidas de la Ciudad de Juan Griego, Isla
de Margarita, Venezuela e identificada por el Laboratorio de Cultivo de
Zooplancton del Instituto de Investigaciones Científicas (I.I.C.) de la
Universidad de Oriente, Núcleo Nueva Esparta, Venezuela.
La selección de Moina macrocopa obedeció a la disponibilidad de cepas por
parte del I.I.C.; la existencia de protocolos estandarizados para bioensayos de
toxicidad específicos descritos por Rodríguez y Esclapés (1995) y Esclapés
(1999); su condición cosmopolita, reportándose en Venezuela en los estados
Carabobo, Aragua y Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y Esclapés,
1995; Hernández et al, 1999); su importancia ecológica y su sensibilidad a
ambientes intervenidos; además de ser organismos de fácil mantenimiento bajo
condiciones de laboratorio.
Preparación del Material de Vidrio
Toda la vidriería utilizada se limpió de acuerdo a la metodología descrita
por Esclapés (1999).
Preparación del Medio de Cultivo:
Se siguieron los protocolos estándares de Esclápes (1999).
Solución madre de KCl:
Se colocaron 8 g de KCl (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, se
aforó a 1 l con agua destilada y se almacenó en botellas de polietileno de 1
l.
Solución madre de MgSO4:
Se colocaron 120 g de MgSO4 anhidro (grado reactivo) en un balón
volumétrico de 1 l, y se aforó a 1 l con agua destilada. La solución así
preparada se almacenó en botellas de polietileno de 1 l hasta su uso.
Solución madre de NaHCO3:
Se colocaron 96 g de NaHCO3 (grado reactivo) en un balón volumétrico
de 1 l, se aforó a 1 l con agua destilada y se almacenó en botellas de
polietileno de 1 l.
Agua sintética dura:
Se añadieron 18,2 l de agua destilada en un envase plástico limpio de 20 l, y
se adicionaron 2,4 g de CaSO4.2H2O a 1 l de
agua destilada, contenida en un vaso precipitado de 2 l mezclando hasta disolver
por completo el soluto. Esta solución se transfirió al envase de 20 l donde se
mezcló con el agua contenida en el recipiente mencionado.
Adicionalmente se agregaron al envase de 20 l las soluciones madres en los
siguientes volúmenes:
- 20 ml de KCl
- 20 ml de MgSO4
- 40 ml de NaHCO3
Se suministro aireación durante más de 2 horas.
En el laboratorio de Ambiente de C.V.G. Bauxilum se determinó la dureza cálcica,
dureza magnésica y dureza total del agua sintética dura.
Agua del río Orinoco:
El 31 de octubre de 2001 a las 8 a.m. se tomó una muestra de 160 l de agua del
río Orinoco en el muelle de C.V.G. Bauxilum, estado Bolívar, Venezuela. El
agua se filtró con un tamiz de 60 m m, fue caracterizada por el laboratorio de
Ambiente de C.V.G. Bauxilum y se almacenó en cuatro envases plásticos de 40 l.
Antes de su utilización se sometió durante 15 h a rayos ultravioleta para su
desinfección y se suministro aireación por 2 h.
Cultivo de Moina macrocopa:
Dependiendo del tipo de bioensayo a ser utilizados, los organismos de Moina
macrocopa se colocaron en vasos precipitados de 2 l, con 1 l de agua sintética
dura o de agua del río Orinoco. Después de realizar un recambio de agua diario
del 75 %, los organismos se alimentaron con alimento formulado para zooplancton
Z-plus® de la marca comercial Zeigler®, a una ración de
180 mg/l. Debido que el alimento es de tamaño de partícula de 100 - 150 µm,
se permitió su disolución en medio de cultivo durante 30 min y finalmente, se
pasó por un tamiz de 60 µm. Semanalmente se cambiaron de recipiente para la
limpieza del envase y tres veces por semana mediante limpieza de fondo se
extrajeron las mudas y otros sedimentos con una micropipeta digital de 200 -
1000 m l marca Labsystems®.
Durante el cultivo se mantuvo una temperatura de 20 ± 1 ºC; fotoperíodo de 9
h luz, 15 h oscuridad y no se suministró aireación. Cuando se observo
disminución en la fecundidad o presencia de machos se dividieron las cepas en réplicas
para reducir la densidad de los organismos.
Los cladóceros se aclimataron durante 15 días a las nuevas condiciones de
laboratorio antes de ser utilizados en los bioensayos.
Obtención de Neonatos
El día anterior a las pruebas, fueron separadas 40 hembras presentando
embriones en avanzado estado de desarrollo. Cada hembra se colocó en un tubo de
ensayo de 25 ml de capacidad con 15 ml de medio de cultivo, manteniendo las
mismas condiciones de cultivo, excepto por el fotoperíodo que no se le aplicó.
A las 24 h se confirmaba la presencia de neonatos y estos se separaban con una
micropipeta digital de 200 - 1000 m l marca Labsystems® transfiriéndose
a botellas de cultivo de vidrio Kimax® de 250 ml de capacidad con
100 ml de solución de exposición, comenzando por el control y terminando con
las concentraciones más altas. Se tomó especial cuidado en el proceso
transferencia para no añadir demasiado medio de cultivo con el objeto de no
alterar las concentraciones.
Solución Madre de Hidróxido de Sodio (NaOH)
Se preparó una solución madre de hidróxido de sodio (NaOH) de 1000 mg/l a
partir de hidróxido de sodio (NaOH) (P.M. 40,00 gr/mol) en lentejas marca
Riedel-de Haën® con calidad A.C.S (American Chemical Society). Se
tomaron 1000 mg de hidróxido de sodio, se disolvieron en agua destilada y
desionizada y se aforó a 1 l. Se almacenó en envase de vidrio.
Preparación de diluciones de hidróxido de sodio (NaOH)
Las soluciones de hidróxido de sodio se elaboraron empleando vidriería volumétrica,
a partir de la solución madre de hidróxido de sodio de 1000 mg/l diluyéndose
con agua sintética dura o agua del río Orinoco dependiendo del bioensayo a ser
realizado, en un volumen de 1000 ml.
Se determinó sodio total en todas las diluciones utilizadas en los ensayos por
espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer® 1100B.
Bioensayos Agudos Preliminares:
Estas pruebas se realizaron con la finalidad de establecer el intervalo de
concentraciones de las soluciones de exposición de hidróxido de sodio (NaOH)
que serían utilizadas en las pruebas finales (Tabla 1).
Tabla 1 Condiciones presentes durante los bioensayos de toxicidad aguda
con Moina macrocopa
|
Factor
|
Condición
|
|
Temperatura
|
20 ± 1 °C
|
|
Tipo de luz
|
Iluminación del ambiente de lab.
|
|
Fotoperíodo
|
10:14 h luz:oscuridad
|
|
Envase prueba
|
De vidrio de 250 ml
|
|
Volumen de exposición
|
100 ml
|
|
Edad de animales prueba
|
Neonatos £ 24 h
|
|
N° de animales por envase
|
5
|
|
N° de réplicas por concentración
|
4
|
|
N° organismos totales por concentración
|
20
|
|
Alimentación
|
No
|
|
Aireación
|
No
|
|
Agua de dilución
|
Agua sintética dura (160-180 mg/l CaCO3) /Agua del río
Orinoco
|
|
Duración del ensayo
|
48 h
|
|
Tipo
|
Estático sin renovación
|
Los bioensayos se realizaron en botellas de cultivo de vidrio
Kimax® de 250 ml.
Se utilizaron las diluciones de prueba (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de hidróxido
de sodio con agua sintética dura y (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de hidróxido de
sodio con agua del río Orinoco. Cada ensayo dispuso de un control sin hidróxido
de sodio.
Bioensayo Agudo Final:
Luego de determinadas las diluciones de hidróxido de sodio (NaOH) a utilizar
mediante los bioensayos preliminares, se procedió con los ensayos finales. La
diferencia en la sensibilidad presentada por Moina macrocopa en los dos medios
expuestos a NaOH determinó el uso de concentraciones distintas.
Bioensayo agudo final con agua sintética dura:
Se sometieron los organismos a cinco diluciones (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de
hidróxido de sodio y un control sin hidróxido de sodio, todos con sus
respectivas réplicas. Se hicieron observaciones del número de organismos vivos
y muertos, considerándose muertos aquellos individuos sin movimiento del corazón
mediante la observación con microscopio estereoscópico Nikon®; a
los 15 min, 30 min, (1, 2, 4, 8, 24, 36, 48) h.
Se determinó el pH y el oxígeno disuelto (OD) a (0, 24 y 48) h en botellas de
Winkler de 300 ml, el pH con equipo Orion® 720A y el oxígeno
disuelto con un YSI® 58.
Bioensayo agudo final con agua del río Orinoco:
Se siguió el mismo diseño experimental descrito en el bioensayo anterior pero
con las concentraciones (15, 18, 20, 23 y 25) mg/l de hidróxido de sodio y se
utilizó agua del río Orinoco como medio de dilución.
Las concentraciones de NaOH utilizadas en los bioensayos finales se
establecieron dentro del rango donde se presenta la concentración letal media
para Moina macrocopa, permitiendo un eficiente cálculo mediante los programas
computarizados utilizados.
Análisis de Datos:
Los datos obtenidos fueron analizados mediante los programas Binomial, Logit,
Moving Average y Probit, utilizando el programa computarizado de Stephan 1977
(Esclapés, 1999).
3. Resultados y discusión
Agua Sintética Dura
El cultivo de cladóceros puede realizarse con éxito en muchos tipos de aguas
naturales, pero es preferible el uso de medios sintéticos reconstituidos. Estos
medios son fáciles de preparar, producen resultados predecibles y permiten una
adecuada tasa de crecimiento y reproducción (Clesceri et al, 1998). La especie
Moina macrocopa generalmente habita en ambientes acuáticos que presentan una
dureza total superior a 150 mg/l CaCO3 (Esclapes, 1999). En la Tabla
2 se observan los valores de dureza presentes en el medio de cultivo.
Tabla 2 Determinación de valores promedios de durezas presentes en el medio de
cultivo agua sintética dura
|
Factor
|
Valor
|
|
Dureza cálcica mg/l
|
75,1
|
|
Dureza magnésica mg/l
|
87,2
|
|
Dureza total mg/l
|
162,3
|
La dureza total obtenida (162,3 mg/l) es acorde al rango preparado (160 - 180
mg/l CaCO3) y resulta ideal para el cultivo de la especie.
El pH del medio varió durante el cultivo y los ensayos en un rango de 8,1 -
9,0; con un promedio de 8,5. Lewis y Weber (1985) señalan un rango óptimo de
pH entre 7,0 - 8,6 para Daphnia.
Agua del Río Orinoco
Tabla 3 Caracterización de los factores físico-químicos presentes en el agua
del río Orinoco utilizada en los bioensayos
|
Factor
|
Valor
|
* Límite o Rango Máximo
|
|
Temperatura ºC
|
28,3
|
|
|
pH
|
6,439
|
Min 6,5 y máx 8,5
|
|
Oxígeno disuelto mg/l
|
6,56
|
Mayor 5,0
|
|
Demanda química de oxígeno mg/l
|
19,1
|
|
|
Demanda bioquímica de oxígeno mg/l
|
8
|
|
|
Alcalinidad mg/l
|
6,7
|
|
|
Dureza cálcica mg/l
|
7,5
|
|
|
Dureza magnésica mg/l
|
2,4
|
|
|
Dureza total mg/l
|
9,9
|
|
|
Conductividad µMHOS
|
30
|
|
|
Turbidez UNT
|
32
|
|
|
Color Unidades de Pt-Co
|
150
|
|
|
Sólidos sedimentables ml/l
|
0,1
|
|
|
Sólidos disueltos mg/l
|
0,0056
|
Desviación menor de 33 % de condición natural
|
|
Sólidos suspendidos mg/l
|
0,0011
|
|
|
Sólidos totales mg/l
|
0,0067
|
|
|
Coliformes totales NMP/100 ml
|
540
|
1000
|
|
Aceites y grasas mg/l
|
No se detecta
|
0,3
|
|
Fenoles mg/l
|
0,606
|
0,002
|
|
Fluoruros mg/l
|
No se detecta
|
|
|
Cloruros mg/l
|
1,85
|
|
|
Hierro mg/l
|
1
|
|
|
Calcio mg/l
|
1,1
|
|
|
Magnesio mg/l
|
0,6
|
|
|
Sodio mg/l
|
1,2
|
|
|
Potasio mg/l
|
0,6
|
|
|
Aluminio mg/l
|
0,9
|
|
|
SiO2 mg/l
|
0,2
|
|
- Según Gaceta Oficial Nº 5021. Decreto Nº 883. Aguas Tipo 4A.
El pH (6,439) y los fenoles (0,606 mg/l) se encuentran fuera de los valores
permitidos en el Decreto Nº 883 (Gaceta Oficial Nº 5021, 1995) si clasificamos
el uso de la muestra de agua del río Orinoco como agua de Tipo 4A (Aguas
destinadas a balnearios, deportes acuáticos, pesca deportiva, comercial y de
subsistencia. Aguas para el contacto humano total).
C.V.G. (1999) encontró valores máximos de fenoles de 0,15 mg/l los cuales
pueden ser provenientes de los efluentes por los lavados de aceites de motores
en las industrias y principalmente de los depósitos de brea de la industria del
aluminio. La aparición de estos altos valores de fenoles (0,606 mg/l) en la
muestra del agua del río puede provenir principalmente de procesos industriales
metalúrgicos de Alcasa, Venalum y Sidor, y de descargas del colector pluvial
municipal.
La presencia de fenoles en las aguas puede causar sabores y olores desagradables
al producirse clorofenoles por la aplicación de procesos de cloración; además
son compuestos tóxicos que pueden causar daños a la salud del ambiente
(COVENIN, 1992). Al sumar varias aguas residuales distintas, se supone que los
efectos tóxicos de todas ellas son estrictamente aditivos (FAO, 1981). Estos
compuestos pueden haber provocado un efecto sinérgico del hidróxido de sodio
sobre Moina macrocopa.
El pH del río Orinoco (6,439) aunque se encuentra por debajo del límite mínimo
(6,5) estipulado en el decreto Nº 883 (Gaceta Oficial Nº 5021, 1995) para
aguas Tipo 4A, es una condición normal para este río. C.V.G. (1999) encontró
un pH entre 6,2 y 9,8 con una media de 6,9; Lewis y Sauders (1990) un promedio
de 6,8; y Vásquez y Sánchez (1984) reportaron una variación entre 5,9 y 8,3
con un promedio de 7.
Cultivo de Moina macrocopa
Los organismos se adaptaron positivamente a las nuevas condiciones de
laboratorio y a los dos medios de cultivos utilizados, se observó un aumento
considerable de la densidad antes de los siete días de cultivo. Fue necesaria
la disminución de la densidad semanalmente para garantizar gran cantidad de
hembras en estado de gravidez.
Se encontró en una oportunidad la presencia de machos y de efipios en la cepa
con agua sintética dura, los cuales se eliminaron al disminuir la densidad.
Ruppert y Barnes (1996) indican que determinados factores, como pueden ser
cambios en la temperatura del agua o un descenso de la disponibilidad de
alimento debida a un aumento de la población, inducen a la aparición de
machos, y se producen huevos fecundados.
Posteriormente se dispuso de mayor control a la densidad para que no
representara una condición limitante en el crecimiento de la población.
Los factores más importantes que controlan el crecimiento poblacional y
reproducción de los cladóceros son la temperatura, intensidad de luz, cantidad
y calidad de alimento (Ojala et al, 1995). Tortorelli y Hernández (1995)
recomiendan como condiciones favorables para Daphnia, como material biológico
de bioensayo, temperatura de 20 ± 1 ºC y fotoperíodo 12 h luz – 12 h
oscuridad. López y Cabrera (1988) señalan que la mejor condición de
crecimiento de población de algunos cladóceros es aplicar un fotoperíodo de
12 h luz - 12 h oscuridad. En el presente trabajo no existió esta misma condición
pero se empleo un fotoperíodo de 9 h luz - 15 h oscuridad, período recomendado
por Esclapés (1999), manteniendo la temperatura a 20 ± 1 ºC.
Baillieul y Blust (1999) en su experiencia con Daphnia magna expuesta a cadmio
utilizaron una temperatura de 20 ± 1 ºC, fotoperíodo 14 h luz – 10 h
oscuridad y un pH ≈ 8; mientras el Centro Internacional de Investigaciones
para el Desarrollo (1998) sugiere una temperatura de 21 ± 2 ºC y un fotoperíodo
de 16 h luz / 8 h oscuridad, demostrando que los parámetros físico-químicos
varían un poco de autor a autor pero todos se ubican dentro del rango utilizado
en el presente bioensayo.
Los individuos consumían el alimento, lo cual se comprobó al presentar el
tracto digestivo lleno. La ración del alimento Z-plus® suministrada
(180 mg/l) diariamente fue la recomendada por Jiménez (2000). Esta resultó
eficiente para los organismos y debido al recambio diario de agua no se
presentaron problemas si esta no era consumida totalmente. En el trabajo de Jiménez
(2000) el alimento para zooplancton Z-plus® fue el que presentó
mayor crecimiento poblacional en salinidad de 0 ‰ para Moina macrocopa al ser
comparado con dietas de levadura y de la microalga Scenedesmus abundans.
Las respuestas positivas de Moina macrocopa a los medios de cultivo indica que
las condiciones establecidas resultaron óptimas.
Preparación de Diluciones de Hidróxido de Sodio (NaOH)
Las concentraciones de sodio total determinadas, en todas las diluciones
utilizadas en los bioensayos, por espectrofotometría de absorción atómica
resultaron muy similares a las esperadas, indicando que las diluciones se
prepararon correctamente (Tabla 4).
Tabla 4 Concentraciones de sodio total presentes en las soluciones utilizadas en
los bioensayos
|
Solución
|
Concentración de Sodio (Na) mg/l Observada
|
Concentración de Sodio (Na) mg/l Esperada
|
|
Agua sintética dura
|
52,4
|
52,6
|
|
Agua sintética dura 23 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
66,5
|
65,8
|
|
Agua sintética dura 25 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
68,8
|
67,0
|
|
Agua sintética dura 28 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
70,2
|
68,7
|
|
Agua sintética dura 30 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
72,5
|
69,9
|
|
Agua sintética dura 33 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
74,8
|
71,6
|
|
Agua sintética dura 35 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
77,3
|
72,7
|
|
Agua sintética dura 50 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
89,7
|
81,4
|
|
Agua sintética dura 65 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
100,9
|
90,0
|
|
Agua sintética dura 75 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
104,4
|
95,7
|
|
Agua sintética dura 100 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
119,4
|
110,1
|
|
Agua del río Orinoco
|
1,2
|
|
|
Agua del río Orinoco 15 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
9,8
|
9,8
|
|
Agua del río Orinoco 18 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
11,7
|
11,6
|
|
Agua del río Orinoco 20 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
12,9
|
12,7
|
|
Agua del río Orinoco 23 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
14,4
|
14,4
|
|
Agua del río Orinoco 23 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
14,5
|
14,4
|
|
Agua del río Orinoco 25 mg/l NaOH (Bioensayo Preliminar)
|
15,6
|
15,6
|
|
Agua del río Orinoco 25 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
15,8
|
15,6
|
|
Agua del río Orinoco 28 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
17,5
|
17,3
|
|
Agua del río Orinoco 30 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
18,9
|
18,5
|
|
Agua del río Orinoco 33 mg/l NaOH (Bioensayo Final)
|
20,8
|
20,2
|
Se presentó sedimento de color blanco en las soluciones más altas de hidróxido
de sodio (pH > 10,6) con agua sintética dura. En aguas sumamente alcalinas
(pH 11) una fracción del calcio disuelto se puede precipitar (Margalef, 1983).
El sedimento encontrado pueden ser carbonatos de calcio precipitados al existir
un aumento de pH en las diluciones, pero este no interfirió en las botellas
utilizadas en los bioensayos ya que se tomo la parte superior de la solución y
el sedimento fue despreciado.
Bioensayos Agudos Preliminares
Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura
No existió muerte en ninguna solución durante las primeras 4 h de exposición.
Todas las concentraciones probadas (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de NaOH
reportaron un 100 % de mortalidad a las 48 h, y las cuatro mayores a las 36 h.
El control presentó tres individuos muertos (15 %) (Tabla 5, Figuras 7 y 8).
Tabla 5 Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo
preliminar con agua sintética dura
|
Tiempo (H)
|
Porcentaje de mortalidad
|
|
Control
|
35 mg/l NaOH
|
50 mg/l NaOH
|
65 mg/l NaOH
|
75 mg/l NaOH
|
100 mg/l NaOH
|
|
0,25
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
0,50
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
1,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
2,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
4,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
8,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
30
|
5
|
|
24,00
|
0
|
10
|
80
|
85
|
90
|
100
|
|
36,00
|
0
|
75
|
100
|
100
|
100
|
100
|
|
48,00
|
15
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|

Fig 7.- Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo
preliminar con agua sintética dura.

Fig 8.- Porcentaje de mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo
agudo preliminar con agua sintética dura a las 48 horas.
Las concentraciones de hidróxido de sodio (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l
utilizadas en este bioensayo resultaron sumamente tóxicas para los individuos
de Moina macrocopa, provocando la muerte de todos los organismos expuestos.
Nancy-Metz (2002) reportan un CL50 en 24 h de hidróxido de sodio en
Daphnia de 150 mg/l, lo cual es un valor alto al compararlo con los resultados
obtenidos en el bioensayo preliminar de agua sintética dura donde se encontró
un 80 % de mortalidad de Moina macrocopa al exponerlo a 50 mg/l de NaOH a las 24
h.
Las Tablas 6 y 7 muestran los valores obtenidos de oxígeno disuelto y pH
respectivamente. El oxígeno disuelto varió entre 8,52 y 9,02 mg/l en todas las
soluciones. El pH fue diferente en todas las concentraciones observándose los
menores valores en el control (8,146) y en 35 mg/l de NaOH (9,807), y el mayor
valor para 100 mg/l de NaOH (11,219); con una desviación con respecto al
control de 1,658 - 2,917. Esto sugiere que el hidróxido de sodio fue el
responsable del aumentó de pH.
Tabla 6 Valores de Oxígeno Disuelto (OD) determinados en el Bioensayo agudo
preliminar con agua sintética dura
|
Tiempo (H)
|
Oxígeno Disuelto mg/l
|
|
Control
|
35 mg/l NaOH
|
50 mg/l NaOH
|
65 mg/l NaOH
|
75 mg/l NaOH
|
100 mg/l NaOH
|
|
0
|
8,96
|
9,02
|
9,00
|
8,99
|
9,00
|
8,99
|
|
24
|
8,76
|
8,89
|
8,94
|
8,94
|
8,95
|
8,99
|
|
48
|
8,52
|
8,81
|
8,78
|
8,85
|
8,82
|
8,91
|
|
Media
|
8,75 ± 0,13
|
8,91 ± 0,06
|
8,91 ± 0,07
|
8,93 ± 0,04
|
8,92 ± 0,05
|
8,96 ± 0,03
|
|
Desviación estándar
|
0,220
|
0,106
|
0,114
|
0,071
|
0,093
|
0,046
|
|
Desviación con respecto al Control
|
0
|
0,16
|
0,16
|
0,18
|
0,17
|
0,21
|
|
Tabla 7
|
Valores de pH determinados en el Bioensayo agudo preliminar con agua
sintética dura
|
|
Tiempo (H)
|
pH
|
|
Control
|
35 mg/l NaOH
|
50 mg/l NaOH
|
65 mg/l NaOH
|
75 mg/l NaOH
|
100 mg/l NaOH
|
|
0
|
8,255
|
9,969
|
10,313
|
10,660
|
10,891
|
11,219
|
|
24
|
8,393
|
9,994
|
10,349
|
10,675
|
10,897
|
11,196
|
|
48
|
8,146
|
9,807
|
10,237
|
10,598
|
10,793
|
11,131
|
|
Media
|
8,265 ± 0,072
|
9,923 ± 0,059
|
10,300 ± 0,033
|
10,644 ± 0,024
|
10,860 ± 0,033
|
11,182 ± 0,027
|
|
Desviación estándar
|
0,124
|
0,102
|
0,057
|
0,041
|
0,058
|
0,046
|
|
Desviación con respecto al Control
|
0
|
1,658
|
2,035
|
2,379
|
2,595
|
2,917
|
Bioensayo agudo preliminar con agua del río Orinoco
Debido a que existió un 100 % de mortalidad en las concentraciones (35, 50, 65,
75 y 100) mg/l de NaOH utilizadas en el bioensayo preliminar con agua sintética
dura, se experimentó con menores concentraciones (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de
NaOH en el ensayo de biobusqueda con agua del río Orinoco.
No se presentaron muertes en ninguna concentración durante las primeras 2 h de
exposición. Todas las concentraciones
utilizadas (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de NaOH presentaron por lo menos un 70 %
de mortalidad a las 48 h, las tres concentraciones más altas tuvieron un 100 %.
El control no presentó mortalidad (Tabla 8, Figuras 9 y 10).
|
Tabla 8
|
Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo
preliminar con agua del río Orinoco
|
|
Tiempo (H)
|
Porcentaje de mortalidad
|
|
Control
|
23 mg/l NaOH
|
25 mg/l NaOH
|
28 mg/l NaOH
|
30 mg/l NaOH
|
33 mg/l NaOH
|
|
0,25
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
0,50
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
1,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
2,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
4,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
5
|
15
|
|
8,00
|
0
|
0
|
0
|
30
|
45
|
15
|
|
24,00
|
0
|
10
|
5
|
80
|
65
|
80
|
|
36,00
|
0
|
45
|
70
|
95
|
100
|
100
|
|
48,00
|
0
|
70
|
95
|
100
|
100
|
100
|

|
Fig 9.-
|
Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo preliminar con
agua del río Orinoco.
|

|
Fig 10.-
|
Porcentaje de mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo
agudo preliminar con agua del río Orinoco a las 48 horas.
|
A las 36 h de exposición las concentraciones mayores de NaOH (30 y 33) mg/l
provocaron la muerte a todos los cladóceros; a las 48 h no se encontró ningún
individuo vivo en 28 mg/l y sólo uno en 25 mg/l. En la menor concentración (23
mg/l) murieron 14 organismos (70 %) a las 48 h. Lo que indica que la CL50
se encuentra por debajo de esta concentración.
El oxígeno disuelto osciló entre 8,57 y 9,03 mg/l en todas las soluciones de
exposición (Tabla 9). El pH presentó una media de 6,490 en el control,
mientras en las demás diluciones se ubicó por encima de 10,4; con una desviación
con respecto al control superior a 3,95 (Tabla 10).
|
Tabla 9
|
Valores de Oxígeno Disuelto (OD) determinados en el Bioensayo agudo
preliminar con agua del río Orinoco
|
|
Tiempo (H)
|
Oxígeno Disuelto mg/l
|
|
Control
|
23 mg/l NaOH
|
25 mg/l NaOH
|
28 mg/l NaOH
|
30 mg/l NaOH
|
33 mg/l NaOH
|
|
0
|
8,78
|
9,03
|
9,00
|
9,00
|
8,96
|
8,95
|
|
24
|
8,60
|
9,01
|
8,97
|
8,94
|
8,94
|
8,91
|
|
48
|
8,57
|
8,91
|
8,70
|
8,81
|
8,85
|
8,82
|
|
Media
|
8,65 ± 0,07
|
8,98 ± 0,04
|
8,89 ± 0,10
|
8,92 ± 0,06
|
8,92 ± 0,03
|
8,89 ± 0,04
|
|
Desviación estándar
|
0,114
|
0,064
|
0,165
|
0,097
|
0,059
|
0,067
|
|
Desviación con respecto al Control
|
0
|
0,33
|
0,24
|
0,27
|
0,27
|
0,24
|
|
Tabla 10
|
Valores de pH determinados en el Bioensayo agudo preliminar con agua
del río Orinoco
|
|
Tiempo (H)
|
pH
|
|
Control
|
23 mg/l NaOH
|
25 mg/l NaOH
|
28 mg/l NaOH
|
30 mg/l NaOH
|
33 mg/l NaOH
|
|
0
|
6,483
|
10,456
|
10,509
|
10,621
|
10,690
|
10,763
|
|
24
|
6,455
|
10,435
|
10,560
|
10,617
|
10,688
|
10,774
|
|
48
|
6,533
|
10,456
|
10,583
|
10,663
|
10,682
|
10,803
|
|
Media
|
6,490 ± 0,023
|
10,449 ± 0,007
|
10,551 ± 0,022
|
10,634 ± 0,015
|
10,687 ± 0,002
|
10,780 ± 0,012
|
|
Desviación estándar
|
0,040
|
0,012
|
0,038
|
0,025
|
0,004
|
0,021
|
|
Desviación con respecto al Control
|
0
|
3,959
|
4,061
|
4,144
|
4,197
|
4,290
|
La concentración de oxígeno disuelto se ubicó en un rango óptimo en todas
las concentraciones (entre 8,57 y 9,03 mg/l); a diferencia del pH que se presentó
sumamente elevado (> 10,4) en las diluciones de NaOH. La diferencia en la
desviación con respecto al control del pH entre las diluciones de NaOH en el
agua sintética dura (1,658 - 2,917) y en el río Orinoco (3,959 - 4,290)
demuestran que el pH sufrió un mayor aumento en el río, aun cuando las
concentraciones de sodio utilizadas en el agua sintética dura fueron
superiores.
Bioensayos Agudos Finales
Bioensayo agudo final con agua sintética dura
El control no presentó muertes y sólo en 30 mg/l de NaOH ocurrió 100 % de
mortalidad a las 48 h. En ninguna concentración ocurrieron muertes durante las
primeras 8 h de exposición. El mayor aumento de mortalidad se ubicó entre 25 y
28 mg/l de NaOH, de 7 (35 %) a 18 (90 %) muertes respectivamente, indicando que
entre ese rango se ubica en CL50. La mortalidad en las tres
concentraciones mayores fue similar (18, 20 y 19 muertes) representando más del
90 % de mortalidad (Tabla 11, Figuras 11 y 12).
|
Tabla 11
|
Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo final con
agua sintética dura
|
|
Tiempo (H)
|
Porcentaje de mortalidad
|
|
Control
|
23 mg/l NaOH
|
25 mg/l NaOH
|
28 mg/l NaOH
|
30 mg/l NaOH
|
33 mg/l NaOH
|
|
0,25
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
0,50
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
1,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
2,00
|
0
|
0
|
0
|
0
|
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