1. Introducción

Los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el grado de afectación que una sustancia química tiene en organismos vivos y éstos pueden ser agudos o crónicos. Las pruebas agudas cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico a una especie en particular. El valor calculado se denomina concentración letal media (CL₅₀) y corresponde a la concentración de un xenobiótico que causa la muerte al 50 % de la población experimental al cabo de un tiempo determinado, generalmente en 48 o 96 horas. En contraste, las pruebas crónicas estiman la concentración – efecto media (CE₅₀) de la sustancia de prueba que causa un efecto al 50 % de la población experimental, al cabo de un tiempo determinado (Rodríguez y Esclapés, 1995).
Para regular las descargas de aguas residuales tóxicas hay que utilizar datos de ensayos de toxicidad hechos con organismos vivos y confiar en estos datos, además de efectuar estudios detallados de las características físicas y químicas de los contaminantes y de los cambios que ocurren después de su descarga en el medio. Cuando se puedan describir con precisión en términos químicos y físicos los componentes tóxicos de un contaminante y se disponga de técnicas analíticas pertinentes y de suficiente información acerca de la toxicidad de esos componentes para los organismos acuáticos, se podrán establecer normas para tales contaminantes en valores numéricos para los componentes tóxicos (FAO, 1981).
Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en organismos vivos bajo condiciones de laboratorio, se han incrementado en estos últimos tiempos debido a la brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis letales y subletales (CL₅₀) que afectan negativamente organismos vivos en los ambientes marinos, estuarinos y dulceacuícolas (Villamar, 1996).
El uso de bioensayos para la evaluación de toxicidad de sustancias liberadas al medio a través de efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores propios de los ambientes evaluados, lo cual favorece indirectamente la preservación de la biodiversidad local. Sin embargo, la variabilidad en la aplicación de las técnicas experimentales para el mantenimiento de organismos silvestres afecta la interpretación y comparación de los resultados entre laboratorios, por lo que se hace necesario desarrollar metodologías estandarizadas para establecer condiciones controladas (Palacios y Pereira, 1997). Utilizar organismos provenientes directamente del hábitat natural puede distorsionar los resultados obtenidos por fuentes de variabilidad no previstas, como nutrición, dinámica de la población, estrés por depredación, etc. (Sosnowski et al., 1979). Estas variables pueden ser controladas o eliminadas con las poblaciones de laboratorio; además, el entrecruzamiento consanguíneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas poblaciones, resulta en una considerable reducción de la variabilidad genética (Lewontin, 1974).
Por otra parte, a causa de la complejidad del medio ambiente acuático y de las comunidades biológicas que lo integran es difícil establecer el grado de deterioro que afecta a las especies o comunidades acuáticas. Por esta razón es conveniente realizar bioensayos utilizando organismos vivos en condiciones controladas de laboratorio. Sin embargo, el objetivo primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cómo afectaría a los organismos vivos en su medio natural y para ello es recomendable paralelamente investigar continuamente las comunidades en su propio hábitat (Villamar, 1996).
La captación y utilización de zooplancton como biomonitor data desde comienzos del siglo XX, hoy en día, gracias al desarrollo de técnicas para su cultivo en el laboratorio, representa una herramienta que gana cada vez más reconocimiento en la evaluación ecotoxicológica (Sosnowski et al., 1979; Maciorowski, 1981). Según Reish y Oshida (1987), para la realización de bioensayos es conveniente el uso de zooplancton por su pequeña talla; requerimiento de poco espacio de laboratorio y poco volumen de agua; gran sensibilidad a sustancias tóxicas; ciclo de vida corto; requerimientos nutricionales generalmente conocidos, lo cual lo hace ideal para estudios de bioacumulación.
Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los bioensayos de toxicidad se encuentran los cladóceros, también llamados pulgas de agua, son crustáceos pequeños que constituyen la mitad de la Clase Branchiopoda (Figura 1). El caparazón (bivalvo) encierra al tronco, pero no a la cabeza y suele terminar posteriormente en una espina apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio mediano, también posee antenas frecuentemente largas y utilizadas en la natación. Además, presenta de cuatro a seis pares de apéndices troncales y el potsabdomen esta girado ventralmente hacia delante. La mayoría de estos organismos son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en agua dulce (Ruppert y Barnes, 1996).

Figura 1.- Vista general de cladóceros, Daphnia pulex.
Fuente: Microsoft Encarta 2001.
En condiciones favorables se reproducen partenogenéticamente (asexualmente) (Figura 2) cada tres o cuatro días, siendo la población constituida solamente por hembras. Si el medio se torna desfavorable se reproducen sexualmente, apareciendo en la población hembras que producen huevos de resistencia llamados efipios y machos, los cuales fecundaran estos huevos. Si las condiciones ambientales vuelven a ser favorables estos efipios darán hembras partenogenéticas (Tortorelli y Hernández, 1995).

Fuente: UDEC. 2001. http://www.udec.cl/bioensayos/recursos_biologicos.html
Debido a su amplia distribución, su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos, se les considera especies indicadoras de condiciones ambientales adversas. Además, por ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio, normalmente se utilizan en pruebas de toxicidad acuáticas. En Venezuela existen numerosas especies de cladóceros que habitan los lagos naturales y artificiales, zonas inundables y charcas temporales (Rodríguez y Esclapés, 1995). En este sentido, Moina macrocopa (Figura 3) es una especie cosmopolita, un crustáceo encontrado tanto en agua dulce como salobre, habita en lugares donde las temperaturas oscilan entre 5 y 30 °C y con un pH del agua desde neutral hasta ligeramente alcalino (Rodríguez y Esclapés, 1995; Martínez y Gutiérrez, 1997). Esta especie, como muchas otras de cladóceros, tolera lugares donde existen abruptas disminuciones en la concentración de oxígeno disuelto y alcanzan altas densidades en cuerpos de agua con gran cantidad de materia orgánica (Martínez y Gutiérrez, 1997). Esta especie es de talla relativamente grande comparada con otras especies presentes en nuestro país, es fácil de cultivar en el laboratorio, posee alta fecundidad y su ciclo de vida es de 60 días a 20 °C. Se encuentra en ambientes acuáticos con una dureza total que excede a los 150 mg/l de CaCO₃ (Esclapés, 1999). En Venezuela ha sido reportada en Valencia, Edo. Carabobo, en el Edo. Aragua y en la Isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999).

Figura 3.- Vista general de Moina macrocopa.
Fuente: Lebendfutter-Zuchtansatz. 2001.
Existen numerosos trabajos realizados con cladóceros sometiéndolos a metales pesados: Pereira y García (1994), Rodríguez y Esclapés (1995), Martínez-Tabche et al.(1997), Baillieul y Blust (1999), Esclapés (1999). También se han hecho experiencias utilizando insecticidas como contaminantes: Bergling y Dave (1984), Gliwicz y Sieniawska (1986), Chu et al. (1997), Dewey y Parker (1998), demostrando que estos organismos son ampliamente utilizados como bioindicadores.
La empresa Bauxilum, de la Corporación Venezolana de Guayana (C.V.G.), se encarga de las extracciones de bauxita y de la producción de alúmina, utilizadas comercialmente para la elaboración de aluminio metálico. El proceso Bayer (Bayer, 1887), como paso intermedio en la obtención del aluminio, es la etapa industrial que extrae el óxido de aluminio contenido en la bauxita. Este proceso genera un residuo o desecho que se conoce como "lodo rojo", que es una suspensión sólido/líquido, constituida principalmente por 20 - 30 % de sólidos y una solución acuosa cáustica. Los sólidos están constituidos por una fracción gruesa formada principalmente por arena silícica, y una fracción muy fina con un alto contenido óxidos de hierro. Además, el lodo rojo contiene: óxido de aluminio residual, sílice, óxido de titanio y soda cáustica (NaOH), ésta última disuelta en la fracción líquida, lo cual le da un carácter alcalino con pH superior a 12 (Manrique y Crespo, 1998).
Los hidróxidos son irritantes oculares y graves irritantes cutáneos; muy corrosivos para ojos, piel y membranas mucosas (Greenpeace, 2001). Particularmente el hidróxido de sodio es una sustancia tóxica entre 50 y 500 mg/kg según la clasificación de Nancy - Metz (2002). La DL₅₀ por vía oral para conejo es de 500 mg/kg. Por otra parte, tiene efectos tóxicos en peces y plancton como consecuencia del cambio de pH que produce; llegando incluso a ocasionar la muerte de peces (Merck^®, 1999).
En caso de inhalación produce quemaduras de las mucosas. El contacto con la piel y con los ojos ocasiona quemaduras y hasta perdida de la vista; por ingestión causa irritación de las mucosas de la boca, la garganta, el esófago y el tubo digestivo, con peligro de perforación del esófago y el estómago (Nancy - Metz, 2002).
El hidróxido de sodio es irritante y corrosivo de los tejidos. En biopsias de piel realizadas a personas voluntarias exponiéndolas a disoluciones de NaOH 1 N en los brazos de 15 a 180 minutos se observaron cambios progresivos, empezando con disolución de células en las partes callosas, pasando por edema y llegando incluso a destrucción total de la epidermis en 60 minutos (UNAM, 1998).
Se han reportados casos de disolución total de cabello, calvicie irreversible y quemaduras del cuero cabelludo en trabajadores expuestos a disoluciones concentradas de hidróxido de sodio por varias horas. Las disoluciones de concentración menor del 0,12 % dañan la piel humana en aproximadamente 1 hora. Por otro lado, una disolución acuosa al 5 % genera necrosis cuando se aplica en la piel de conejos por 4 horas (UNAM, 1998).
La CL₅₀-96h de NaOH en peces es 189 mg/l y en organismos acuáticos la CL₅₀ se encuentra entre 10 – 100 mg/l en 96 h (Merck^®, 1999).
C.V.G. Bauxilum deposita su desecho de producción, lodo rojo, en tres lagunas adyacentes al río Orinoco (Figura 4), Ciudad Guayana, Edo. Bolívar. Este sistema lagunar fue construido en 1979 con un diseño para 21 años de vida útil. Debido a que la capacidad del sistema original ya fue agotada, se han hecho modificaciones para prolongar su vida, como elevaciones de los diques (Figura 5) y construcción de diques filtrantes (CAVSA, 2001a).

Figura 4.- Vista general de lagunas de lodo rojo.

Figura 5.- Elevaciones de los diques de las lagunas de lodo rojo.
Dichas lagunas actualmente presentan problemas de filtración, debido a falta de obras de ingeniería que las acondicione a recibir el producto del proceso (pantallas impermeables) y al gran volumen en ellas depositadas (lodo rojo, agua de lluvia); permitiendo el paso de este material a otras lagunas naturales o al río Orinoco. Además en períodos de lluvia por el aumento de volumen en las lagunas existe la posibilidad que ocurran desbordamientos, aunque nunca ha sucedido.
El almacenamiento de los lodos rojos constituye un problema de gran magnitud para la industria del aluminio a nivel mundial (Stinson, 1979). Las bajas velocidades de sedimentación de los lodos rojos hacen que los embalses requieran cada vez mayores extensiones de terreno. Por otro lado la soda cáustica (NaOH) constituye un factor de contaminación ambiental. El rebose inesperado de un embalse de almacenamiento, debido a condiciones climatológicas, podría generar la contaminación y muerte de los ríos y afluentes aledaños a la planta (Manrique y Crespo, 1998). Además, las características tixotrópicas de los lodos rojos inducen problemas de consolidación, invalidando las áreas o lechos de embalses para efectos de construcción o reforestación (Nguyen y Boger, 1983).
El 24 de junio del año 2001 fueron reportadas en la prensa local "Correo del Caroní" (Pág. A -1) muertes extrañas de peces en la laguna natural de Cambalache, estado Bolívar, Venezuela. Graffe (2001) estudia la existencia de filtraciones en el Dique Nº 12 de las lagunas de lodo rojo, el cual se intercepta con el canal Nº 5 para aguas de escorrentía que culmina en la laguna natural de Cambalache. Estas filtraciones representan una posible causa de la mortandad de peces ocurrida en dicha laguna. Las filtraciones están siendo remediadas temporalmente mediante el uso de bombas que devuelven el desecho a las lagunas de deposición (Figura 6).

La Dirección Estadal del Ministerio del Ambiente y de los Recursos Naturales del estado Bolívar, Venezuela, expone el 9 de julio del 2001, en un reporte a la prensa local "Correo del Caroní" (Pág. D - 1), la necesidad de realizar experiencias con organismos vivos para determinar si realmente el lodo rojo fue la causa de muerte de los peces. Es importante señalar que en dicha zona descargan los desechos de una granja de porcinos, de una fábrica de bloques y además existe el relleno sanitario municipal Cambalache (Graffe, 2001).
Esta situación es alarmante ya que en dicha zona se encuentran viviendo aproximadamente 9.500 personas que tienen libre acceso a las lagunas naturales y de lodo rojo, llegando incluso algunos a pescar y consumir el agua de las lagunas naturales, como por ejemplo, la laguna de Cambalache.
No se encuentra estipulado en algún decreto o norma de las leyes venezolanas las concentraciones máximas permisibles de hidróxido de sodio en los vertidos líquidos.

Objetivo General
Determinar, mediante el uso de bioensayos agudos, el efecto del hidróxido de sodio (NaOH) principal componente del desecho (lodo rojo) de la empresa C.V.G. Bauxilum, sobre el cladócero Moina macrocopa.
Los objetivos específicos son:

• Determinar la concentración letal media (CL₅₀) para ejemplares de Moina macrocopa, sometidos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando agua sintética dura.
• Determinar la concentración letal media (CL₅₀) para ejemplares de Moina macrocopa, sometidos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando agua del río Orinoco
• Comparar la sensibilidad presentada por los ejemplares de Moina macrocopa, expuestos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH), en agua sintética dura y en agua del río Orinoco.

2. Materiales y métodos

Organismo Experimental
Los bioensayos se realizaron con la especie Moina macrocopa (Straus, 1820), la cual fue colectada del canal de aguas servidas de la Ciudad de Juan Griego, Isla de Margarita, Venezuela e identificada por el Laboratorio de Cultivo de Zooplancton del Instituto de Investigaciones Científicas (I.I.C.) de la Universidad de Oriente, Núcleo Nueva Esparta, Venezuela.
La selección de Moina macrocopa obedeció a la disponibilidad de cepas por parte del I.I.C.; la existencia de protocolos estandarizados para bioensayos de toxicidad específicos descritos por Rodríguez y Esclapés (1995) y Esclapés (1999); su condición cosmopolita, reportándose en Venezuela en los estados Carabobo, Aragua y Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999); su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos; además de ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio.

Preparación del Material de Vidrio
Toda la vidriería utilizada se limpió de acuerdo a la metodología descrita por Esclapés (1999).
Preparación del Medio de Cultivo:
Se siguieron los protocolos estándares de Esclápes (1999).
Solución madre de KCl:
Se colocaron 8 g de KCl (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, se aforó a 1 l con agua destilada y se almacenó en botellas de polietileno de 1 l.
Solución madre de MgSO₄:
Se colocaron 120 g de MgSO₄ anhidro (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, y se aforó a 1 l con agua destilada. La solución así preparada se almacenó en botellas de polietileno de 1 l hasta su uso.
Solución madre de NaHCO₃:
Se colocaron 96 g de NaHCO₃ (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, se aforó a 1 l con agua destilada y se almacenó en botellas de polietileno de 1 l.
Agua sintética dura:
Se añadieron 18,2 l de agua destilada en un envase plástico limpio de 20 l, y se adicionaron 2,4 g de CaSO₄.2H₂O a 1 l de
agua destilada, contenida en un vaso precipitado de 2 l mezclando hasta disolver por completo el soluto. Esta solución se transfirió al envase de 20 l donde se mezcló con el agua contenida en el recipiente mencionado.
Adicionalmente se agregaron al envase de 20 l las soluciones madres en los siguientes volúmenes:

• 20 ml de KCl
• 20 ml de MgSO₄
• 40 ml de NaHCO₃

Se suministro aireación durante más de 2 horas.
En el laboratorio de Ambiente de C.V.G. Bauxilum se determinó la dureza cálcica, dureza magnésica y dureza total del agua sintética dura.

Agua del río Orinoco:
El 31 de octubre de 2001 a las 8 a.m. se tomó una muestra de 160 l de agua del río Orinoco en el muelle de C.V.G. Bauxilum, estado Bolívar, Venezuela. El agua se filtró con un tamiz de 60 m m, fue caracterizada por el laboratorio de Ambiente de C.V.G. Bauxilum y se almacenó en cuatro envases plásticos de 40 l. Antes de su utilización se sometió durante 15 h a rayos ultravioleta para su desinfección y se suministro aireación por 2 h.

Cultivo de Moina macrocopa:
Dependiendo del tipo de bioensayo a ser utilizados, los organismos de Moina macrocopa se colocaron en vasos precipitados de 2 l, con 1 l de agua sintética dura o de agua del río Orinoco. Después de realizar un recambio de agua diario del 75 %, los organismos se alimentaron con alimento formulado para zooplancton Z-plus^® de la marca comercial Zeigler^®, a una ración de 180 mg/l. Debido que el alimento es de tamaño de partícula de 100 - 150 µm, se permitió su disolución en medio de cultivo durante 30 min y finalmente, se pasó por un tamiz de 60 µm. Semanalmente se cambiaron de recipiente para la limpieza del envase y tres veces por semana mediante limpieza de fondo se extrajeron las mudas y otros sedimentos con una micropipeta digital de 200 - 1000 m l marca Labsystems^®.
Durante el cultivo se mantuvo una temperatura de 20 ± 1 ºC; fotoperíodo de 9 h luz, 15 h oscuridad y no se suministró aireación. Cuando se observo disminución en la fecundidad o presencia de machos se dividieron las cepas en réplicas para reducir la densidad de los organismos.
Los cladóceros se aclimataron durante 15 días a las nuevas condiciones de laboratorio antes de ser utilizados en los bioensayos.

Obtención de Neonatos
El día anterior a las pruebas, fueron separadas 40 hembras presentando embriones en avanzado estado de desarrollo. Cada hembra se colocó en un tubo de ensayo de 25 ml de capacidad con 15 ml de medio de cultivo, manteniendo las mismas condiciones de cultivo, excepto por el fotoperíodo que no se le aplicó.
A las 24 h se confirmaba la presencia de neonatos y estos se separaban con una micropipeta digital de 200 - 1000 m l marca Labsystems^® transfiriéndose a botellas de cultivo de vidrio Kimax^® de 250 ml de capacidad con 100 ml de solución de exposición, comenzando por el control y terminando con las concentraciones más altas. Se tomó especial cuidado en el proceso transferencia para no añadir demasiado medio de cultivo con el objeto de no alterar las concentraciones.

Solución Madre de Hidróxido de Sodio (NaOH)
Se preparó una solución madre de hidróxido de sodio (NaOH) de 1000 mg/l a partir de hidróxido de sodio (NaOH) (P.M. 40,00 gr/mol) en lentejas marca Riedel-de Haën^® con calidad A.C.S (American Chemical Society). Se tomaron 1000 mg de hidróxido de sodio, se disolvieron en agua destilada y desionizada y se aforó a 1 l. Se almacenó en envase de vidrio.

Preparación de diluciones de hidróxido de sodio (NaOH)
Las soluciones de hidróxido de sodio se elaboraron empleando vidriería volumétrica, a partir de la solución madre de hidróxido de sodio de 1000 mg/l diluyéndose con agua sintética dura o agua del río Orinoco dependiendo del bioensayo a ser realizado, en un volumen de 1000 ml.
Se determinó sodio total en todas las diluciones utilizadas en los ensayos por espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer^® 1100B.

Bioensayos Agudos Preliminares:
Estas pruebas se realizaron con la finalidad de establecer el intervalo de concentraciones de las soluciones de exposición de hidróxido de sodio (NaOH) que serían utilizadas en las pruebas finales (Tabla 1).

 

• Según Gaceta Oficial Nº 5021. Decreto Nº 883. Aguas Tipo 4A.