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Biotecnologia vegetal Aplicaciones del cultivo de meristemas apicales de tallo


Enviado por Biotec. Emilio Alfredo Lucas Carrillo
Código ISPN de la Publicación: EpZZpVZZyEPXCWYYqP


Resumen: Morfogenesis en el Meristemo Apical. Multiplicacion masiva de vegetales. Recuperacion de plantas libres de patogenos. Termoterapia. Quimioterapia.(V)


   

  

Índice

  1. Morfogénesis en el Meristemo Apical.
  2. Multiplicación masiva de vegetales.
  3. Recuperación de plantas libres de patógenos.
  4. Termoterapia.
  5. Quimioterapia.
  6. Bibliografía.

     

1. Morfogénesis en el Meristemo Apical.

Las pruebas para cultivar ápices y meristemas aislados de diferentes angiospermas datan del siglo pasado. En 1893 Rechinger intentó crecer en arena, con y sin nutrientes adheridos, yemas aisladas de Populus nigra y Fraxinus ornus L.; se observó formación de callos básales y una ligera expansión de las partes superficiales, aunque no hubo desarrollo del sistema radicular (citado por Sahbdé y Murashige, 1977).

Yemas aisladas de Ceratopteris thalictroides (Brougn, 1908) crecieron en turba, produciendo hojas que fueron más pequeñas y morfológicamente más simples que las de las plantas progenitoras ( citado por Sahbdé y Murashige, 1977).

Posteriormente, Robbins (1922ª) hizo los primeros intentos para cultivar ápices aislados en un medio artificial (in vitro). Apices de col de 1 cm de diámetro (Brassica oleracea, var capitata), maíz (Zea mays) y algodón (Gossypium herbaceum) mostraron un desarrollo limitado cuando crecieron en un medio que contenía sales inorgánicas y glucosa; solo hubo respuesta en los ápices de col y maíz en condiciones de oscuridad (se observó desarrollo de hojas cloróticas y algunas raíces).

Withe (1933) obtuvo resultados positivos al cultivar ápices aislados de Sellaria media en gotas colgantes, en donde los ápices sobrevivieron algunas semanas. Hubo formación de pequeños primordios y no se observó diferenciación completa.

Ball (1946) realizó un ensayo con ápices de Tropaeolum majus L. y Lupinus albus L., dos angiospermas morfológica y fisiológicamente diferentes. El inóculo consistió en el meristemo apical más tres primordios de hoja y algunos tejidos subyacentes de tallo. Los ápices de ambas plantas desarrollaron plantas completas en diferentes medios nutritivos. La importancia de Ball radica en que surgió que la perpetuación del crecimiento y organogénesis en meristemos apicales de angiospermas requiere de tallos subyacentes y primordios de hoja.

El primer resultado positivo fue reportado por Wetmore y Morel (1949), y Wetmore (1954), con criptógamas vasculares como Adiantum spp, Osmunda spp y Seleginella spp. Las puntas de esas plantas medían de 100 a 150µ de longitud y se desarrollaron en solución de Knop y 3% de sacarosa (este medo resultó inadecuado para plantas superiores).

Ball (1960) probó el cultivo de meristemas apicales de Lupinus albus L. en un medio que contenía aminoácidos, leche de coco, ácido giberélico y vitaminas, observando sólo una pequeña elongación del meristemos. Al repetir el experimento, dejó algunos primordios de hoja al meristemos y obtuvo plantas completas. Con base en estos resultados Ball concluye que: a) El meristemo apical exhibe una dependencia hormonal y nutricional por el tallo subyacente y primordios de hoja, y b) El meristemo apical de angiospermas sufre una diferencia bioquímica que le impide producir ciertas sustancias esenciales para el crecimiento y mantenimiento de un meristemo determinado.

Smith y Murasihge (1970) desarrollaron plantas completas a partir de meristemos apicales de Nicotiana glauca Grah., Tropaeolum majus y Coleus blumei Beenth, en un medio que contenía sales inorgánicas de Murashige y Skoog (1962), 100 mg/l de inositol, 04 mg/l de tiamina – HCL, 1 a 2 mg/l de AIA, 30 g/l de sacarosa y 1% de agar, se obtuvo el desarrollo de las hojas a los 12 días. Ellos demostraron que fueron innecesarias las estructuras subyacentes, pues se obtuvieron plántulas completas en un medio que solo contenía AIA administrado de manera exógena. En un cultivo de meristemo apicales de Coleus blumei, los cuales incluían dos o más pares de primordios de hoja, Smith (1970) confirma las observaciones de Ball (1960), con respecto a que no se requerían sustancias de crecimiento exógenas si el inóculo incluía primordios foliares; si el primordio de hoja no estaba presente el abastecimiento de AIA era critico; el ácido giberélico reprime la iniciación de hojas y raíces y la adenina parece revertir ligeramente la reprensión.

Shabdé y Murashige (1977) demostraron la dependencia de fuentes hormonales de los meristemos apicales de clavel en hojas subyacentes y tejidos en tallo. Esto se debe a que cuando se inocula el demo meristemático en ausencia de primordios de hojas expandidas se deben incluir auxinas y citoquininas exógenas en el medio. Jacobs (1961) mencionó que en Coleus blumei la síntesis máxima de auxinas se observó en el segundo par de primordios de hoja y Shabdé confirma esta síntesis de auxinas en el mismo sitio; sin embargo, la fuente de citoquininas se encuentra en el primer par de hojas expandidas.

Como se sabe, un balance adecuado de auxinas y citoquininas in vitro induce la formación de yemas y/o raíces, dependiendo de la concentración de ambas y de la especie en que esté actuando, lo que implica que las hojas jóvenes son capaces de producir las auxinas necesarias para el desarrollo adicional de la raíz y que cuando maduran sintetizan citoquininas que promueven la formación de brotes, ya sean primordios y hojas o yemas laterales (la principal fuente de citoquininas son las raíces).

Cuando se aísla el meristemo apical debe dañarse la región subdistal (Wardlaw, 1965), ya que se inicia la formación de yemas si la incisión es profunda y daña el tejido provascular; si el tejido provascular no es dañado se inicia la formación de hojas. Estas observaciones demostraron que los metabolitos necesarios para el crecimiento y desarrollo del meristemo apical pudieron ser transportados a través del tejido provascular (Wardlaw, 1945; 1949 y 1956).

Cabe recordar que la relación auxina – citoquinina in vitro es indispensable para la morfogénesis de los meristemos y que las investigaciones actuales se centran en encontrar la concentración optima, tanto de la auxina como de la citoquinina, tomando en cuenta las variaciones de respuesta interespecífica que presentan los vegetales.

2. Multiplicación masiva de vegetales.

La facilidad de usar la técnica de cultivo de tejidos vegetales para la multiplicación masiva produce material vegetal in vitro por la iniciación de brotes adventicios, bulbos, tubérculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas axilares y producción masiva de plántulas a partir de meristemos.

Los propagadores comerciales ya tienen estandarizado el método de mantenimiento de un lote comercial de material madre in vitro, en donde, además de tener la ventaja de mantener este material, se considera el gran número que se puede mantener en un espacio reducido con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y sanidad deseables. Esto es debido al potencial morfogenético que tienen los meristemos y otros tejidos de la planta en la producción de brotes.

Existen muchos géneros vegetales que se propagan por cultivo de tejidos para la obtención de grandes cantidades de plantas de importancia comercial, como son Anturium andreanum, Dieffenbachia amoena Snow, D. picta Perfection, Philodendron oxycurdium, Scindapsus aureus, Syngonium podophyllum, Chrysanthemum morifolium, Gerbera jamesonni, Begonia spp, Saxifraga sarmontosa Tricolo, etc.

3. Recuperación de plantas libres de patógenos.

Muchos cultivos comerciales vegetales, particularmente los que son propagados vegetativamente, contiene virus sistemáticos, los cuales afectan su funcionamiento o abaten su rendimiento. Por tanto, antes de librarse comercialmente es deseable producir plantas libres de virus, que pueden ser clonalmente multiplicadas.

En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos (Hollings, 1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicación por estos medios y se hacen necesarias otros métodos.

Actualmente la alternativa de más éxito es el cultivo de meristemas apicales, frecuentemente combinado con quimioterapia o con tratamientos de calor. Cuando estos métodos son usados, las plantas no solo son liberadas del virus,sino también de hongos y otros patógenos.

El primer cultivo con resultados satisfactorios fue el de Morel y Martín (1952), quienes cultivaron ápices de dalias infectadas con virus y lograron obtener plantas sana. Morel (1955) realizó un cultivo meristemático con Cymbidium, Cattleya y Phajus, obteniendo orquídeas libres de virus, y en 1960 reporta que es necesario hacer ciertas modificaciones en el medio, ya que géneros como Vlanda y Phalaenosis no responden favorablemente (citado por Lecoufle, 1969).

Existen otras investigaciones en plantas ornamentales, pero solo se han mencionado las más importantes, por los aportes que han brindado en este campo.

En cuanto a especies hortícolas y frutales se han realizado importantes investigaciones en relación con la obtención de material sano a partir de meristemos apicales; los más relevantes fueron hechos en papa (Sussex, 1963; Ingram y Robertson, 1965; Accatino, 1966; Gregorini y Lorenzi, 1964; Mellor y Stace – Smith, 1977; Wang, 1977 y Solórzano, 1983), chile (Juo, Wahg y Chien, 1973), fresa (Belkengren y Muller, 1962), manzano (Elliott 1972; Jones, 1976; Aboot, 1976; Jones y Hopgood, 1979), vid (Barlass y Skene, 1978), etc.

4. Termoterapia.

Consiste en la aplicación de altas temperaturas a las plantas completas o partes aisladas:

40 ºC, 7 días

erradicación de Aimv

40 ºC, 9 días

erradicación de Cmv

32 ºC, 16 a 168 días

Virus detectados

32 ºC, 46 a 48 días

Erradicación de virus

(Walkey, 1976)

 

Algunos virus son más estables que otros, y esto causa diversos problemas en su erradicación, por lo que necesitan periodos más largos para unos y más cortos para otros, con diferentes tratamientos. Algunas especies son dañadas por las altas temperaturas continuas, por lo que se recomienda una alternancia de temperaturas altas y bajas, disminuyéndose así los daños causados en los tejidos de las plantas.

5. Quimioterapia.

Es la aplicación de productos químicos al medio de cultivo, lo que ocasiona una mayor probabilidad de obtener plantas de patógenos, por lo que al aplicarse diferentes productos quimioterapéuticos de manera exógena al medio de cultivo, estamos asegurando la obtención de material sano.

En el cultivo de ápices de papa (Solanum tuberosum L.) se aplicó verde de malaquita como agente quimioterapéutico, observándose en los resultados un mayor número de plantas libres de virus "X" (Norris, 1954; Oshima y Livingstone, 1961) obtuvo resultados semejantes al incluir en el medio 2, 4 – D, obteniendo una mayor frecuencia de plantas sanas.

Johnstone y Wade (1974) sugieren que al aplicar altas concentraciones de citoquininas y auxinas estás actúan favoreciendo o estimulando el crecimiento activo del hospedero, pero no el de la partícula viral. No hay muchas evidencias al respecto, pero se dice que los reguladores del crecimiento reducen la concentración del virus pero no lo erradican (Gohen y Walkey, 1978).

Estudios quimioterapéuticos más recientes sugieren que incorporando al medio de cultivo metabolitos químicos como el Kibavirin (virazole), que es un producto antiviral, se puede erradicar el virus (Mough, 1976).

Combinando la quimioterapia con el cultivo de meristemos de tabaco infectado con virus "X" de la papa se logró una erradicación total del mismo (Sherpard, 1977); más recientemente ha sido incorporado el vizarole aa concentraciones de 50 y 100 mg/l, encontrándose que erradicó el CMV de tejido meristemático de Nicotiana rustica.

Como se puede observar, los avances obtenidos en la técnica de cultivo de meristemos, auxiliada con la aplicación de termoterapia y quimioterapia, ha tenido grandes logros en cuento a la aplicación de las técnicas a diferentes especies.

Cabe mencionar que en los países desarrollados, en los últimos años, se han establecido compañías que se dedican a propagar de una manera comercial diferentes especies, que incluyen hortalizas, cultivos básicos, frutales, especies forestales, plantas medicinales, etc.

En la página siguiente se muestra un esquema representativo de cómo se debe llevar a cabo un programa de producción de plantas libres de virus a nivel comercial.

 

Producción de plantas libres de virus a partir del cultivo in vitro de meristemo apicales (Walkey, 1980)

 

 

La selección de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que van a obtener son idénticas al progenitor (propagación asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sería deseable conocer el virus especifico presente, pues así las condiciones de cultivo varían, aplicándose termoterapia o simplemente cultivo de meristemos.

El tamaño del inóculo también es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de diámetro, y ápices de tallo que miden de 0.1 a 0.3 mm de diámetro; generalmente el número de plántulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamaño del meristemo o ápice cultivado (Walkey, 1978).

Por último, es importante señalar que el medio de cultivo es un factor esencial, ya que en él juegan un papel vital los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales, específicos de la especie que estemos cultivando; éstos deben de ser semejantes a los que se tienen en condiciones naturales.

El proceso de cultivo in vitro incluye varias tapas, que son:

     

  1. Etapa I. Establecimiento del cultivo aséptico.
  2. Etapa II. Propagación de propágulos sanos (subcultivos).
  3. Etapa III. Enraizamiento de los propágulos obtenidos.
  4. Etapa IV. Transplante a suelo y acondicionamiento a invernadero.

     

En la etapa I se inoculan los meristemos o ápices en tubos de cultivo; a los pocos días se observa si hay proliferación de organismos contaminantes (hongos o bacterias); los tubos de cultivo contaminados deben eliminarse y los que se mantienen sanos se deben revisar periódicamente para observar el desarrollo de lo que será la futura planta (formación de hojas, yemas, tallo, etc.). Esta etapa comprende de 4 a 6 semanas.

En la etapa II se deben separar los propágulos obtenidos y pasarlos a un medio fresco para la proliferación de nuevos brotes y para el desarrollo de los mismos. De acuerdo con la cantidad de material que se necesite, serán los subcultivos que deben hacerse. Se recomienda no excederse de cinco subcultivos, ya que el vigor de la planta y calidad de la misma pueden decrecer. Cada subcultivo dura de 4 a 6 semanas.

En la etapa III se procede al enraizamiento de los propágulos para la obtención de plantas completas; dura de 2 a 4 semanas.

En la etapa IV la textura, el pH y la composición del sustrato estarán dados en las condiciones especificas de la especie que se trate. La etapa de acondicionamiento a invernadero dura de 6 a 8 semanas.

Las plantas identificadas como libres de virus (material nuclear) serán propagadas in vitro para obtener el material fundación. Estas se propagarán por los métodos tradicionales para obtener plantas registradas y, finalmente, plantas e calidad certificada.

Cuando las plántulas regeneradas se han establecidos en el suelo, la indexación de virus debe efectuarse varias veces durante el primer año siguiente a la obtención, ya que existen ciertos virus cuya resurgencia es retardada. Las condiciones de manejo deben ser cuidadosas y de este material se le conoce como material nuclear. Cuando este material se propaga por lo métodos in vitro, puede ser almacenado por largos periodos a bajas temperaturas (Nullin y Schlegel, 1976), ya que es un método menos costoso que el de mantenerlos en invernaderos especiales, que es lo que se considera como material fundación.

7. Bibliografía.

HURTADO M. Daniel V / MERINO M. María Eugenia. Editorial Trillas. Tercera Edición. Agosto de 1994. México. Pp. 233. Pg. 136 – 148.

 

Autor:
Biotec. Emilio Alfredo Lucas Carrillo

ELUCAS42@HOTMAIL.COM


Enviado por Biotec. Emilio Alfredo Lucas Carrillo
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Publicado Tuesday 17 de February de 2004