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Índice Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de Biología Molecular,
esta es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos
aquellos procesos celulares que contribuyen a que la información genética se
transmita eficientemente de uno seres a otros y se exprese en los nuevos
individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales que
existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro
llamado hospedero, empleando técnicas de ingeniería genética. Gracias a este
avance, se pueden producir fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala,
abriendo así las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos y por
ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o
la obtención de organismos superiores recombinantes.. Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con
hechos que contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biología
molecular, por ejemplo: En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los
principios de segregación y clasificación independiente de los genes. En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el
núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleína. En los años veinte el químico alemán Robert Feulgen,
utilizando una tinción específica descubrió que el DNA estaba situado en los
cromosomas. En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el DNA es el
portador de la información genética. En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del DNA Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos
que conducirían a lo que se llama tecnología del DNA Recombinante . Hablando específicamente de DNA según el modelo de Watson y
Crick, la molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con
polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido
está formado por : 1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa) 2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina,
timina), bases púricas (Adenina, Guanina). 3.- Grupos fosfato. Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo
fosfato formando cadenas muy largas, quedando las bases nitrogenadas en la parte
central unidas cada una al carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con
su eje. Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula
de ADN se mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno
entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan
enfrentadas. La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos.
Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido
nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por
ejemplo: 5 -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3 Esta secuencia representa un oligonucleótido con veinte
bases, de las cuales seis son Adenina (A), tres son Timina (T), ocho son
Citosinas (C) y tres son Guanina (G). El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información
contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5 3 o 3 5 ; el 5 representa el extremo terminal del fosfato y el 3 el extremo final
del átomo de carbono de la desoxirribosa. Estructura secundaria del DNA El DNA es una doble hélice antiparalela ya que el enfrentamiento entre las
bases nitrogenadas es constante; la Adenina siempre se enfrenta con la timina
formando dos puentes de hidrógeno y la Guanina siempre se enfrenta con la
Citosina formando tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que
las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen
sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5 3 y la otra lo hace en sentido 3
5. Estructura terciaria y cuaternaria del DNA Recordemos que la longitud de una hebra de DNA humano es de
varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en
el interior de las células. Estas estructuras, terciaria y cuarternaria,
permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las células
eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA
empaquetado denominado pseudocromosoma. Aspectos básicos de la Biología
Molecular La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del
término genérico de Ingeniería genética y referidas indistintamente como clonación,
DNA recombinante o manipulación génica han sido la causa de pocas áreas
de la biología molecular permanezcan inalteradas. Antes del desarrollo de la
ingeniería genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en
cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto. Una de las sustancias mas importantes y de participación
decisiva en distintos procesos de la Biología Molecular son las enzimas; existen
varias que podemos destacar: Endonucleasas de restricción: Son enzimas que
hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleótidos del
interior de la cadena. Son producidas principalemnete por bacterias que
hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto del DNA de doble hebra en
secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las
mas útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia
absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Estas
enzimas se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera
letra del género y a las dos o tres primeras letras e la especie del organismo
de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de
esa enzima en esa generación. Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las
endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto
es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe
el nombre de palíndromes. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo
esta simétrica respecto al eje binario. Las endonucleasas de restricción
cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 de unos cuatro nucleótidos de
longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos. Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o
RNA "in Vitro". La mayoría de estas enzimas requieren un molde y
sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con
mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. Coli, el fragmento de
Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA),
la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6,
T7 y T3 y la Taq polimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño
cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a
partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere
molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas
preexistentes. Todas ellas requieren Mg2 . Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o
romos), fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5 de los ácidos
nucleicos), quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las
fosfatasas). DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE REACCION EN
CADENA DE LA POLIMERASA En los años setenta se desarrollaron los métodos que
permitieron de manera simple y relativamente rápida para determinar la
secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de DNA. Estos primeros intentos
de secuenciar los ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la
secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos,
determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de
fragmentos solapantes. Este método resulta mas o menos sencillo para proteínas
que resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos distintos, pero
constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia
resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de
reacción en cadena de la Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis
"in Vitro" de secuencias específicas de DNA con la cual la
insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de
Biología Molécular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el
estudio de DNA. La técnica se basa en la replicación del ADN en los
organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la
síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando
un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para
crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers).
Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean
complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea
amplificar. Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la
Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1ª Desnaturalización del ADN doble cadena 2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica
de cada una de las hebras 3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA
polimerasa En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de
ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra
a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá
cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las
zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se
realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C) En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de
una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la
complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA
polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el
medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar gráficamente
en la Figura 1. Figura 1: Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999) Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado
termociclador (fig.2). Este aparato realiza los ciclos en los tiempos y
temperaturas programadas de forma exacta.
Figura 2: Termociclador para reacciones de PCR Observemos en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez
completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al
final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8...Si los ciclos se
producen un número "n" de veces y suponiendo que el número de copias
de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que
la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica.
Figura 3a: Amplificación exponencial del PCR (de Andy
Vierstracte 2001)
Figura 3b: Amplificación exponencial del PCR (de M.E.
Gilles-González 1997) Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la
tercera etapa son de dos tipos: "producto corto" y "producto
largo". El producto corto tiene una longitud perfectamente definida por los
extremos 5´ de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea
amplificar.Es el fragmento que se almacena de manera exponencial durante la
reacción. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales
de la muestra y cuyos extremos 3´ no están definidos. Sin embargo, es
importante aclarar que al final de la PCR, la cantidad del producto corto
sintetizado es muy superior en comparación con el producto largo, por lo
generalmente para posteriores estudios, a partir del producto de la PCR, se
desestima. (fig. 4).
Figura 4: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de
Andy Vierstracte 2001) La detección del producto de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa se realiza normalmente mediante corrido electroforético (fig 5)
dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos
utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas
concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de
estudio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad.
Figura 5: Preparación del corrido electroforético En la actualidad se desarrollan métodos para poder
cuantificar el producto de la PCR, visualizando in situ sobre tejidos (Cao, Y. y
cols, 2000). Lo que hace prever un crecimiento, si cabe mayor, del uso de la técnica
de la PCR. A continuación trataremos de profundizar en los componentes
y parámetros más importantes para obtener una amplificación óptima. Componentes y optimización de la reacción
de amplificación: Muestra de ADN Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde
no sea un problema en la reacción:
Diseño de los iniciadores Para la elección de los primers, existen una serie de normas
que nos pueden ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas de
ordenador que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T) Siendo G, C, T y A el número de cada una de las bases que
forman cada uno de los oligos. La temperatura de hibridación debe ser
aproximadamente 5º menor que la temperatura calculada. DNA Polimerasa Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo
la replicación del ADN, siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden
clasificar en:
Inicialmente se usó el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y cols., 1985) la cual posee actividad 3´-> 5´ exonucleasa que le proporciona la capacidad de cambiar el nucleótido que ha sido erróneamente incorporado. La importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicación del ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolábil por lo que no soporta los ciclos y temperaturas utilizados en una PCR. Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la técnica de la PCR, ya que ha permitido su automatización (desarrollo del termociclador). Como se observa en las Tablas anteriormente descritas, las polimerasas termoestables, como la Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa, lo que las hace menos seguras a la hora de comparar las fidelidades. Por ello hay que intentar conseguir las mejores condiciones para que ésta aumente. Podemos citar:
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Como hemos señalado anteriormente se deben añadir en la solución de la reacción en concentraciones iguales que normalmente oscila entre los 20 y los 200 mbol" > mM. Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relación. No debemos variar ninguno de ello de manera independiente. Se aconseja (Bradley, 1991) que la concentración de Mg++ sea de 0.5 – 1.0 mM veces superior a la concentración de dNTPs. Amortiguador de la reacción Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50 mM KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2. Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10% contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso imprescindibles. Sales Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en forma de sales.
Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortas de ADN. Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas de ADN.
Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la reacción. Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción Temperaturas y tiempos de los ciclos Como hemos explicado anteriormente la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos podemos optimizar la reacción. Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los tubos de un baño María a otro de diferente temperatura (la Tª de desnaturalización, la de hibridación y la de elongación). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difícil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarrolló el termociclador que lo hacía de manera automática. A continuación describiremos de forma más detallada el tiempo y la temperatura de cada una de las etapas de un ciclo. 1.- Desnaturalización Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto Tiene alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo o la temperatura. Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación. En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC. 2.- Hibridación En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los oligonucleótidos: la composición de bases, el tamaño y la concentración. En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y 65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde. 3.- Elongación En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC. Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC. El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una última elongación de 5´a 72ºC. Número de ciclos También adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el número de ciclos que se utilizan. Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera empírica). Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no específicas. Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización. Contaminación en la PCR La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989). Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:
Aplicaciones de la secuenciación de ADN
Detección de mutaciones: La técnica de PCR nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se emplea así en la secuenciación de ADN como un método de diagnóstico: Una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una determinada mutación puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cáncer, etc.) o de una pequeña deleción (deleción de tres bases en el gen CFTR de fibrosis quística ) puede desarrollarse un método de detección rutinario , la secuenciación automática puede implementarse como método de screening para la localización de nuevas mutaciones. secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especimenes de museos y descubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de las moléculas están dañadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciación. Diagnóstico prenatal/Diagnóstico preimplantación: diagnóstico de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in Vitro. Una o dos células del preembrión se retiran en el estado de ocho a dieciséis células, previo a la implantación. Estas pueden utilizarse para amplificar un gen o genes específicos y así estudiar la enfermedad genética o el sexo (utilizando genes específicos del cromosoma Y). Secuenciación de ADNs fósiles: El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especimenes de museo y descubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de las moléculas están dañadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciación. Identificación de especies y Control de cruzas entre animales: Las técnicas para identificar especies pueden ser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie mas barata a los precios de otra mas cara, o el comercio ilegal de especies en peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias altamente variables entre especies distintas, auque sean cercanas entre sí, y bastante conservadas dentro de la misma especie. Los controles de relaciones Familiares entre animales tiene importancia forense para el control de comercio ilegal de especies protegidas. Individuos jóvenes de especies en peligro son sacados de sus lugares de nacimiento y disfrazados por certificados veterinarios falsos. En estos casos el estudio familiar es el único medio de descubrir el origen ilegal de los individuos. Proyecto Genoma Humano: El proyecto genoma humano es un proyecto Internacional cuyo objetivo final es obtener una descripción completa del genoma humano a través de la secuenciación del ADN. El genoma que se investiga es el genoma nuclear. Desde su inicio el proyecto ha sido justificado especialmente por los beneficios médicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de cada gen humano. Esta información proporciona una capacidad de diagnóstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad además de proporcionar un marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, además de nuevas estrategias para la terapia génica.
I.- Prescott Lasing M.,Harley Johon P. 1999, Microbiología cuarta edición Editorial MacGraw Hill Madrid España pp. 320-344 II.- Jaques Monod, Jacob Francois 1996, Biología Molecular décimo segunda edición Editorial Ciencia y Desarrollo México D.F. Pp 9-10 III.- Lisker Rubén, Armendares Salvador 2000, Introducción a la Genética Humana, primera edición Editorial El Manual Moderno México D.F. IV.- Mathews Christopher 1999, Bioquímica segunda edición MacGraw Hill España pp. 94, 101-102, 114 V.-www.bioq.unizar.com.hsa/servicios/ap/biomol VI.-Mas Eva, Poza Julio; Ciriza Jesús 2001, Revista Acuatic No. 15 Fundamento de la reacción en cadena de la Polimerasa. Universidad de zaragoza españa VII.- Rodríguez T. Gemma, Santiago Matz. Ma. Concepción 2000 Estudio del ADN, Secuenciación automática de ADN Publicación del Instituto de Investigaciones Biomédicas.
Q.C. Margarita Lozada Méndez
Enviado por Q.C. Margarita Lozada Méndez
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