Índice:
- crecimiento
microbiano:
- medición
del crecimiento microbiano:
- crecimiento
en cultivo intermitente:
- factores
que afectan la rapidez de crecimiento:
- consumo
de nutrientes y formación de producto:
- rendimiento
de biomasa y de producto:
- cultivo
contínuo:
- aplicaciones
del cultivo continuo:
- conclusiones:
- referencias
bibliográficas:
RESUMEN
La cinética de crecimiento microbiano constituye
una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la
biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de
crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los mismos, sus formas de
aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos, y sobre todo
el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento
trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes
mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la
utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis
de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
10.1.
CRECIMIENTO MICROBIANO:
“El
crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales, puede
mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.
a)
Células individuales o
población de células en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de
vida celular. Procesos en laboratorio.
b)
División estocástica de la
población, o división al azar.
La
división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula,
duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática (salva
los organismos cenóticos). De ésta manera una célula da nacimiento a dos células
hijas de tamaño idéntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y
potencialidades.
En el caso de las levaduras, y otros
microorganismos, se presenta una variante que es ka gemación o botón. Se forma
una pequeña protuberancia que aumenta progresivamente de tamaño, luego se
produce la división en el núcleo y migra hacia el botón. Finalmente crece
hasta un tamaño suficiente y posteriormente se separa formando otra célula idéntica
a la madre. Las células hijas, sin importar el procedimiento de división
celular, deben heredar todo el potencial genético y son idénticas.” (1)
10.2.
MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:
El cálculo
del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo
mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular
(peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular
(grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población).
Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos
indirectos.
Métodos directos:
¨
Recuento
del número de células en una cámara Thoma
¨
Peso
seco celular
¨
Determinación
de nitrógeno o de proteínas totales
¨
Determinación
de DNA
Métodos indirectos:
¨
Recuento
de colonias en placa
¨
Recuento
sobre filtro de membrana
¨
Consumo
de oxígeno
¨
Liberación
de dióxido de carbono
¨
Concentración
de un enzima constitutivo
¨
Decoloración
de un colorante
¨
Incorporación
de precursores radiactivos
¨
Medida
de la turbidez
10.2.1. PESO SECO CELULAR:
El peso seco (contenido de sólidos) de las células
bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para
grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los
miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de
este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede
recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.
“El aumento de volumen con la humedad tiene un límite.
Este va creciendo hasta que la célula alcanza un porcentaje de humedad que
corresponde al punto de saturación de la pared celular, aproximadamente del 30
% para todas las especies en cálculos técnicos. A partir de éste valor el
volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el volumen de las células
no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor del 30 % es
un valor para utilizarlo prácticamente, si bien cada especie tiene su punto de
saturación de la pared celular” (2). No sucede así con el peso, cuyo valor
sigue aumentando hasta alcanzar el contenido máximo de agua para la especie
correspondiente. Como consecuencia de lo anteriormente expuesto, se definen,
para una célula los siguientes pesos específicos:
PESO ESPECÍFICO
ANHIDRO:
ρ0
= Peso
anhidro
(Ec. 10.2.1.1)
Volumen Anhidro
PESO ESPECÍFICO
A H% DE HUMEDAD:
ρk
= Peso
al H% de humedad
(Ec. 10.2.1.2)
Volumen al H% de humedad
Cuando la humedad es del 12 %,se llama peso específico normal.
PESO SECO
VOLUMÉTRICO SATURADO:
Rs = Peso
anhidro
(Ec. 10.2.1.3)
Volumen a H%
Cuando la humedad H
es superior al punto de saturación de la pared celular.
PESO SECO
VOLUMÉTRICO HÚMEDO:
Rk = Peso
anhidro
(Ec. 10.2.1.4)
Volumen
a H%
Siendo, en este caso, la H inferior al punto de saturación de la pared celular.
El volumen ocupado por los huecos se determina por
desplazamiento de fluidos, por lo que estos no deben reaccionar con la pared
celular para obtener un valor exacto del mismo. Se suelen emplear el agua o el
helio, siendo este naturalmente más exacto al ser el helio un gas inerte.
El agua, como veremos, es sorbida molecularmente
por la pared celular, produciendo una compresión de la misma que enmascara el
valor obtenido, cuyo efecto estudiaremos con la hinchazón. Con respecto al peso
específico real de la célula, o más exactamente peso específico de la pared celular, después de numerosos estudios, se
ha encontrado que, con pequeñas variaciones, se puede considerar para todas las
células prácticamente igual a 1,56.
10.2.2. ABSORCIÓN:
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una
partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada,
parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz
dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz
dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución.
Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir
tres tipos de dispersión.
Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas
más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son
muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos.
Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetría: La turbidimetría mide la
reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y
cuantifica la luz residual transmitida.
Estudios teóricos y experimentales han mostrado
que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del
tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración
de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular
del microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy
diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los
tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para
estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos
viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de
calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es
posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de
microorganismos totales o con UFC.
Fig. 10.2.2-1 Absorbancia en función del
Peso Seco
Absorbancia = K x Peso Seco
(Ec. 10.2.2.1)
K: constante que varía con la
longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la
absorbancia(1/W0).
Peso seco: Concentración celular
bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).
La relación directa entre la absorbancia y el peso
seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones
no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen
desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar
suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor
sensibilidad por el bajo nivel de absorción.
Fig. 10.2.2-2 Absorbancia en función del
Peso Seco
Fig. 10.2.2-3 Absorbancia en función del
Número de Microorganismos Totales
En estos gráficos se puede apreciar que
suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco
tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de
microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.
10.2.3. PESO
HÚMEDO:
Se obtiene a partir de una muestra en suspensión
que es pesada luego de la separación de las células por filtración o
centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La
principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas
muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el
5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular.
Para corregir el peso húmedo se determina la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una
centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos
(como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden
atravesar las paredes bacterianas.
10.2.4 VOLUMEN
DE CÉLULAS EMPACADAS Y NÚMERO DE CÉLULAS:
El crecimiento de una población bacteriana puede
ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede
llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células
individuales, esto es iniciar y completar una división celular.
De esta forma, se considera a los microorganismos
como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número
total de partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número
total de microorganismos en una muestra:
¨
Recuento microscópico de partículas
¨
Recuento electrónico de partículas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de
los microorganismos capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en
cuenta el número de microorganismos viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
¨
Recuento de colonias
¨
Método del número más
probable
Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos
moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos,
la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la síntesis de
los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la
división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el
crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema
enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.
10.2.5.1. RECUENTOS
DIRECTOS:
RECUENTO
MICROSCÓPICO:
Es una
técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente
disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir
de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es
obtener reproductibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra
dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio,
incluyendo pipetas.
Esta
adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al
realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica
o medios mínimos sin fuente de carbono).
Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser.
La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión,
aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.
Una de las mayores ventajas del recuento microscópico
es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los
objetos contados.
Fig.
10.2.5.1-1 Cámara de recuento de Petroff-Hausser
Tabla
10.2.5.1-1 Recuento de Microorganismos
|
Tipo
de cuadro
|
Area
[cm2]
|
Volumen
[ml]
|
Factor
[1/Volumen]
|
|
Cuadrado
total
|
1.00 x 10-2
|
2.00 x 10-5
|
5.00 x 104
|
|
Cuadrado
grande
|
4.00 x 10-4
|
8.00 x 10-7
|
1.25 x 106
|
|
Cuadrado
pequeño
|
2.50 x 10-5
|
5.00 x 10-8
|
2.00 x 107
|
(Ec.
10.2.5.1)
1/Dilución: Inversa de la dilución
utilizada para llenar la cámara de recuento.
Número de
cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara
que se utilizaron para contar un el número de bacterias.
Volumen del
cuadrado: Volumen de cada cuadrado de
la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por
ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm
x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)
RECUENTO
ELECTRONICO:
Los contadores electrónicos permiten realizar
recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de
hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan básicamente
de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño conducto.
En ambos compartimientos hay electrodos que miden
la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy
pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada
compartimiento es independiente.
El principio de funcionamiento de estos
instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una
suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través
del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un
microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se
incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del
medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y
contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes.
Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en
la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la
turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden
medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas
de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve
período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es común la
obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.
10.2.6. MASA
DE UN COMPONENTE CELULAR:
“Debido a que la célula no es tan
"lista" (no sabe contar hacia atrás en el tiempo) ni tiene el don de
la predicción (los humanos tampoco, para la mayor parte de las cosas
importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia adelante", ya que
el tiempo de inicio de una ronda de replicación no guarda una relación
sencilla con la división celular previa.” (3)
Entonces,
¿cómo se acoplan división celular y replicación cromosómica? Una clave
hacia la respuesta a esta pregunta es que la razón (proporción) entre orígenes
de replicación y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la
replicación) es igual para todas las tasas de crecimiento. He aquí un modelo
hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos eventos del ciclo
celular:
El sistema de coordinación detecta la concentración
de orígenes de replicación; conforme la bacteria crece, esta concentración va
descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico que desencadena una
nueva onda de replicación. Ello hace que se doble el número de orígenes. Una
ulterior ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo
descender la concentración de orígenes.
Se trataría, pues, de una especie de reloj biológico
y "oscilador" que usaría como medida del tiempo el parámetro de masa
celular, volumen, u otro equivalente, de tal modo que la concentración crítica
de un factor iniciador o la dilución de un represor servirían para disparar la
replicación a una concentración determinada.
Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos que
cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación
(g), mayor es el tamaño medio de las células:
- bacterias
creciendo en un medio relativamente pobre (supongamos que en este medio g =
60min, C+D=g);
- si
transplantamos una célula recién dividida procedente del cultivo anterior
a un medio más rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generación g =
35min) podemos observar que:
Ø
la
primera división ocurre C+D (60 minutos) después; es decir, con un tiempo idéntico
al que tenía en el medio anterior;
Ø
pero
como en este medio g = 35min, la iniciación de una nueva ronda de replicación
ocurre antes de dicha replicación celular (es decir, C y D se superponen);
Ø
se
observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un tamaño celular mayor que en
el medio pobre, y una masa de inicio (tras la división celular) mayor, alterándose
igualmente el tiempo de inicio.
10.2.7. MEDICIONES
FÍSICAS:
Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo
diferentes parámetros físicos, algunos de los cuales se presentan a continuación.
No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parámetros
del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno
de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto.
En este apartado revisaremos los principales métodos
de recuento de microorganismos. Los métodos para el seguimiento de la evolución
de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos
directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas
de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de
contadores de partículas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún
parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución
del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del
cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso.
Entre los métodos principales de recuento de
microorganismos podemos destacar:
- Las
técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía
de contraste de fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un
volumen determinado usando una célula de Petroff-Hauser o de Neubauer
(portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el
volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo;
pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas.
- Contaje
de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter-Counter. La
operación de estos sistemas es sencilla (método de empleo) y permite rápidamente
determinar el número de partículas presentes en una suspensión y la
distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células
vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente
en la suspensión del cultivo.
- Técnicas
de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un
volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará
lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma
que el número de estas nos permitirá estimar el número de células
presentes en la muestra plaqueada (sembrada).
El sistema es fácil de
utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos
filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie
(extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en
profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes
que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento de
microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las
placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística,
es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de
la medida.
- Técnicas
turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de
cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es
proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su
medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que
se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas
(colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda
adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen
denominar valores de densidad óptica. La limitación de este sistema, por
otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muertas y que
normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células
por mililitro.
- Medida
de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de
una membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso
constante. El sistema, obviamente, no diferencia células vivas de muertas y
su sensibilidad es limitada.
- Medida
del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz
por la luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de
O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentración de ATP en un
volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentración
de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida
indirecta detecta únicamente las células vivas.
Los sistemas de medida del crecimiento celular se
han adaptado técnicamente para poder ser utilizados como sistemas on-line. En
una operación on-line no es necesario extraer la muestra del cultivo para
realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran
volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos
de contaminación.
Antes de cerrar este apartado hay que señalar que
en la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que podemos
detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en
el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al 1% de
los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se
cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros
microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofía
(inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos
microorganismos.
10.3.
CRECIMIENTO EN CULTIVO INTERMITENTE:
10.3.1. CINÉTICA
DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO INTERMITENTE:
En este apartado vamos a revisar el estudio de la
cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado
en un volumen finito. a esto se le denomina
cultivo batch y podríamos
traducirlo por cultivo discontinuo
por contraposición con el cultivo continuo que desarrollaremos más adelante.
El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la
siguiente figura:
Fig.
10.3.1-1 Desarrollo de un Cultivo Intermitente
Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:
(1)
La fase
logarítmica, en la que el microorganismo se adapta a las nuevas
condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer
activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto
más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el
microorganismo.
(2)
La
fase exponencial.
(3)
La
fase estacionaria, en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no
significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos
se compensa por la muerte de otros.
(4)
La
fase de muerte, en la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma
exponencial con una constante k que depende de diferentes
circunstancias.
En la fase de muerte decimos que el número de
microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero ¿qué es un
microorganismo vivo en términos microbiológicos?. Consideramos vivo al
microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido
irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este
concepto porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen por
qué estar metabólicamente inactivos.
10.4.
FACTORES QUE AFECTAN LA RAPIDEZ DE CRECIMIENTO:
10.4.1. EFECTO
DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO:
Si [Et] representa la concentración total del microorganismo en
una reacción y [ES] es la concentración del complejo microorganismo-sustrato,
entonces [Et] - [ES] representa la concentración de microorganismo
libre para reaccionar con el sustrato.
Durante una reacción el microorganismo se unirá al sustrato, hasta que
todas las moléculas se saturen. Usualmente la concentración de sustrato [S] es
mayor que [ES], por lo que no resulta un factor limitante. La razón de formación
de [ES] está definida por
[ES] Rate = k1 ([Et] – [ES]) [S]
(Ec. 10.4.1.1)
Mientras que la disociación está definida por
[ES] disociación
rate = k –1 [ES] – k2 [ES]
(Ec. 10.4.1.2)
Mientras haya microorganismo disponible, la razón de k1 irá
aumentando hasta que se saturen. Si las constantes de reacción y disociación
son iguales, la formación del complejo [ES] se mantiene estable al igual que la
velocidad de reacción. O sea que la generación del producto se mantiene
constante mientras la concentración del sustrato no sea limitante. Esto se
definiría como
[ES] =
[Et] [S]
(Ec. 10.4.1.3)
[S]
+ (k2 + k -1) / k1
La velocidad inicial de la reacción está determinada por
v =
k2 [ES]
(Ec. 10.4.1.4)
Si definimos KM como (k2 + k -1) / k1 y
Vmax como k2 [Et], obtenemos que
v = Vmax [S] / KM
+ [S]
(Ec. 10.4.1.5)
Esta es la ecuación de Michaelis-Menten.
En un estudio de cinética microbiana se mide la actividad en términos de
producto formado por minuto, a distintas concentraciones de sustrato. Si la
actividad es graficada en términos de la concentración inicial del sustrato
versus el producto generado en un lapso de tiempo (velocidad de reacción), la
curva generada es una hipérbole rectangular.
La ecuación que describe todos los puntos en esa línea viene dada por v.
Esta ecuación expresa la velocidad para la reacción de un solo sustrato y se
conoce como la ecuación de Michaelis-Menten:
V max
v = Vmax [S]
/ (Km + [S]) (Ec. 10.4.1.6)
v
v = actividad microbiana
V max/2
[S] = concentración de
sustrato
KM
Vmax = actividad a [S] infinito
KM = el valor de [S] que da actividad
[S]
igual a ½ Vmax
Fig. 10.4.1-1
Estos últimos dos parámetros son importantes, porque nos dan información
directa sobre cuán bien el microorganismo se une al sustrato (KM) y
sobre cuán bien el microorganismo convierte el sustrato en producto una vez se
une (Vmax). De hecho, KM es la constante de disociación
dinámica del microorganismo con el sustrato, y Vmax es la
concentración molar del microorganismo por la constante catalítica (Kcat).nas celulares
s transportadores están
10.4.2. EFECTO
DE LA TEMPERATURA:
Todos los microorganismos tienen una temperatura óptima
de crecimiento. Esto significa que a determinada temperatura la velocidad de
duplicación (o la velocidad de crecimiento poblacional) de los microorganismos
es mayor. Hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el
mismo rango de temperaturas:
Tabla
10.4.2-1 Temperatura Óptima de Crecimiento
|
Clasificación
|
Rango
|
Optima
|
|
Termófilos
|
25 - 80 °C
|
50 - 60 °C
|
|
Mesófilos
|
10 - 45 °C
|
20 - 40 °C
|
|
Psicrófilo
|
-5 - 30 °C
|
10-20 °C
|
Fig.
10.4.2-1 Efecto de la Temperatura en el Crecimiento Microbiano
La temperatura afecta la estabilidad de las proteínas
celulares porque induce cambios conformacionales que alteran la actividad biológica
de estos compuestos, especialmente la de enzimas.
10.4.3. EFECTO
DEL pH:
La mayoría de los microorganismos crecen en pH
cercanos a la neutralidad, entre 5 y 9, cosa que no excluye que existan
microorganismos que puedan soportar pH extremos y se desarrollen. Según el
rango de pH del medio en el cual se desarrollan pueden dividirse en:
Tabla
10.4.3-1 Clasificación de los Microorganismos según el pH
|
Clasificación
|
pH
externo
|
pH
interno
|
|
Acidófilos
|
1.0 - 5.0
|
6.5
|
|
Neutrófilos
|
5.5 - 8.5
|
7.5
|
|
Alcalófilos
|
9.0 - 10.0
|
9.5
|
Los microorganismos regulan su pH interno mediante
un sistema de transporte de protones que se encuentra en la membrana citoplasmática,
que incluye una bomba de protones ATP dependiente.
El rango de pH óptimo para el desarrollo de los
microorganismos es estrecho debido a que frente a un pH externo muy desfavorable
se requiere un gran consumo de energía para mantener el pH interno.
10.5.
CONSUMO DE NUTRIENTES Y FORMACIÓN DE PRODUCTO:
De algunos estudios realizados se pudo comprobar
que las bacterias son únicamente una pequeña parte de la estructura, el resto
es una materia de tipo mucilaginoso secretada por las propias bacterias, llamada
matriz extracelular, que absorbe agua y captura pequeñas partículas.
En su interior, el agua fluye llevando a las
colonias bacterianas nutrientes disueltos y retirando los productos de desecho,
que frecuentemente son utilizados por otros tipos bacterianos que forman parte
de la estructura y que están convenientemente distribuidos según sus
intereses.
El flujo de nutrientes no es total en toda la
dimensión del biofilm, en las zonas centrales, la llegada de nutrientes está
de alguna manera regulada por la actividad de las situadas en la periferia, de
la misma manera que éstas están afectadas por la actividad metabólica de las
bacterias que situadas en la zona central de biofilm. Tanto es así, que
elementos importantes para el tipo de metabolismo, como el oxígeno, puede
variar su concentración de forma significativa en centésimas de milímetro.
Esto es un indicativo de que en el mismo biofilm existe diversidad de agentes
bioquímicos.
10.6.
RENDIMIENTO DE BIOMASA Y DE PRODUCTO:
Un aspecto importante en la operación de un
quimostato es la rata de producción de biomasa y de sustancias celulares. La
rata de producción de biomasa por unidad de volumen es el producto de la
concentración de células por la rata de dilución.
Biomasa producida =
sustituyendo el valor de
(Ec. 10.6-1)
Usualmente Ks es pequeño comparado con
Sr y a ratas de dilución inferiores al valor crítico, Dc,
la biomasa producida es aproximadamente igual a D Y Sr. Pero para
valores de D cercanos al valor crítico, donde D =
max,
la expresión:
(Ec. 10.6-2)
Tiende a infinito y la biomasa producida, D X,
desciende a cero. Estos cambios en la producción de biomasa con la rata de
dilución se muestran gráficamente en la Fig. 9 Para la producción de proteína
microbiana se debe operar el quimostato a una rata de dilución que produzca el
máximo de biomasa.
10.7.
CULTIVO CONTÍNUO:
Consiste en mantener la población microbiana en
fase exponencial de crecimiento. Se utiliza en fermentaciones industriales que
requieren actividad metabólica máxima. Los sistemas de cultivo continuo pueden
hacerse funcionar como quimiostatos o como turbidostatos. En un quimiostato la
velocidad de flujo de entrada y salida de nutrientes se mantiene a un valor
determinado de tal manera que la velocidad de crecimiento del cultivo queda
ajustada a esa velocidad de flujo. En un turbidostato el sistema incluye un
dispositivo óptico que regula la turbidez controlando la velocidad de flujo.
Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo
indefinido por un sistema de flujo que se compone de:
Ø
Una cámara
de cultivo de volumen constante a la que llega un suministro de nutrientes, y de
la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un
dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número
de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen
constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con
las células creciendo exponencialmente.
Los parámetros a tener en cuenta son:
Ø
flujo
(f), medido en ml/h
Ø
volumen
de la cámara de cultivo (v, en ml)
Ø
densidad
celular en la cámara (x)
Ø
factor
de dilución D = f/v (en h--1). El inverso de este factor de dilución
es el tiempo medio de residencia (1/D= TMR)
Existe una pérdida de células por el rebosadero:
-dx/dt = x·D. El crecimiento bruto es dx/dt = x·m. Por lo tanto, el
crecimiento neto es dx/dt = x·m - x·D = x·(m - D). Si logramos que el
coeficiente de crecimiento (m ) se haga igual al factor de dilución (D),
entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de células se hace
constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico de
equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se compensan con las ganancias
por crecimiento.
Existen dos tipos de procedimientos para obtener
cultivos continuos:
Ø
de
control interno: turbidostato;
Ø
de
control externo: quimiostato
10.7.1. TEORÍA DEL QUIMIOSTATO:
Se
entiende por tal, el reactor tanque agitado en el que se asume básicamente que:
Ø
El volumen de medio es
constante
Ø
El caudal de salida es igual
al de entrada
Ø
La concentración de salida es
igual a la concentración en el interior del reactor
“El
efecto de la concentración del nutriente sobre el crecimiento total es fácil
de comprender, ya que gran parte del nutriente se convierte en material celular,
y por tanto, si se limita la cantidad de nutriente se convierte en material
celular. La razón del efecto de las concentraciones muy bajas de nutriente
sobre el ritmo de crecimiento es más incierta. Una opinión es que a estas
bajas concentraciones de nutriente éste no puede ser transportado a la célula
a una velocidad suficiente para satisfacer todas las demandas metabólicas de
nutriente. Es presumible que no todos los lugares transportadores están
ocupados. Esta propiedad de alterar el ritmo de crecimiento mediante la
concentración del nutriente se utiliza en el aparato de cultivo continuo
llamado quimiostato.” (4)
La
cosecha máxima es también una función de la especie de organismo y de su
eficacia en convertir nutrientes en masa celular, y de las condiciones
ambientales, tales como el pH y la y temperatura. El papel de la fuente de energía
en el control de la cosecha máxima se estudiará más adelante.
En
la industria de la levadura, la levadura del, pan crece en melazas como fuente
de carbono y energía. Se ha descubierto que si se añaden todas las melazas de
una vez, parte del exceso de azúcar es convertido el alcohol por las células
y, por tanto, es desaprovechado.
En
las fases tempranas del crecimiento exponencial, cuando las densidades celulares
son bajas, sólo es necesaria una pequeña cantidad de azúcar para soportar el
ritmo máximo de crecimiento. Pero a medida que transcurre el tiempo, aumenta la
densidad y se precisa mayor cantidad de azúcar. Lo que se hace en la práctica
es añadir las melazas a un ritmo exponencial paralelo al ritmo de crecimiento
exponencial de la levadura.
Los
antibióticos y otros agentes microbianos afectan al crecimiento de diversas
maneras, y un estudio de la acción de estos agentes en relación con la curva
de crecimiento es una ayuda considerable en la comprensión
de sus modos de acción. La manera más precisa de observar el efecto de
un antibiótico es añadirlo en un grado de concentración inhibidora a un
cultivo en crecimiento exponencial.
El
quimiostato es un dispositivo de cultivo continuo en el cual tanto la densidad
de la población como el ritmo de crecimiento son controlados por el
investigador. Para la regulación del quimiostato se utilizan dos elementos: el
ritmo de flujo y la concentración de un nutriente limitante, como una fuente de
carbono, de energía o de nitrógeno, o factor de crecimiento. Tal como a
concentraciones bajas de un nutriente es rápidamente consumido por el
crecimiento. En los cultivos estáticos el crecimiento es proporcional a la
concentración de dicho nutriente. Sin embargo a estas bajas concentraciones el
nutriente se ha consumido, pero en el quimiostato la adición continua de medio
fresco que contiene el nutriente limitante permite el crecimiento continuo.
Puesto que a bajos niveles de nutrientes utilizados el nutriente limitante es rápidamente
asimilado, su concentración en el quimiosato es siempre cero. Los quimiostatos
han encontrado aplicación en una gran variedad de procedimientos de investigación,
especialmente en los casos en que se desea las poblaciones naturales a menudo
crecen lentamente o a concentraciones bajas de nutriente, los quimiostatos han
sido especialmente útiles como modelos de laboratorio de ecosistemas
microbianos naturales.
10.7.2. ECUACIONES FUNDAMENTALES DEL CULTIVO
CONTINUO:
El estudio del crecimiento de la población se ha
limitado a los cultivos cerrados o estáticos en los que el crecimiento se
produce en un volumen fijado en un medio de cultivo que es alterado por las
acciones de los organismos en crecimiento y que, por ello, ya no es apto para el
crecimiento. En los estadios tempranos del crecimiento exponencial en los
cultivos estáticos las condiciones pueden permanecer relativamente constantes,
pero en los estadios tardíos suelen ocurrir cambios drásticos. Para muchos
estudios es deseable conservar los cultivos en ambientes constantes durante
largos periodos de tiempo, y esto se logra utilizando
cultivos continuos. Un cultivo continuo es e4sencialmenye un sistema de
flujo de volumen constante al que se añade medio continuamente y del que,
gracias a un dispositivo de rebosamiento, se elimina el exceso continuamente.
Una vez que este sistema está en equilibrio, el número de células y el
nutriente permanecen en un status constante y todo el sistema se dice que está
en estado de equilibrio. Un parámetro clave de un dispositivo de cultivo es el
ritmo de dilución, D que se define como:
D= ritmo de flujo = F
(Ec.
10.7.2-1)
Volumen V
- ESTADO NO ESTACIONARIO:
La
muerte de una población a una velocidad logarítmica hace reversible la cuenta
de la población a la misma velocidad de aceleración con que se efectuó el
crecimiento inicial. Uno de los problemas en bacteriología es prevenir este fenómeno
asumiendo la conclusión lógica relacionada con la muerte del cultivo. Muchos
de los métodos y las técnicas de cultivo de colección se relacionan con el
mantenimiento de un número razonable de células viables durante el
almacenamiento. Las bacterias con una activa fase de muerte deben ser
transferidas a medios frescos en intervalos frecuentes. Es común perder un
cultivo cuando no se atiende esta observación. La liofilización y otras técnicas
similares son métodos prácticos para prevenir el daño metabólico que se
presenta en las células inactivas. El final de la fase de muerte puede ser
simplemente la estabilización de esa población en una cuenta baja. Las
infecciones crónicas, en donde el agente etiológico (causante) permanece
latente en un tejido o en un número muy bajo, sin manifestar la patología
activa, pueden ser consideradas como ejemplo de una fase de muerte que se ha
estabilizado de esta manera. Un ejemplo sería la presencia del bacilo de la
tifoidea en la vesícula biliar o en otro órgano del transmisor. Algunas
bacterias, especialmente en los medios diluidos, permanecerán en un bajo nivel
de población en medios artificiales durante años, sin morir en su totalidad y
conservarán la movilidad.
- ESTADO ESTACIONARIO:
En algunas ocasiones es difícil determinar la razón
del cambio de una fase logarítmica a una estacionaria, aunque han surgido por
ahí algunas explicaciones que no son muy satisfactorias. Sin embargo, el análisis
de muchos cultivos diferentes nos muestra que existen dos explicaciones muy
adecuadas. Uno o más nutrientes se agotan, o bien existe una acumulación de
productos tóxicos. Cualquiera de estos fenómenos que ocurra primero será la
causa de la fase estacionara, dependiendo del caso en particular. El tóxico
puede ser tan sólo un cambio a un ácido orgánico o a una base que altere el
pH en un rango no tolerable por esa bacteria. En ciertos medios, Enterobacter
eleva el pH demasiado y el Bacillus subtilis se queda
sin alimento. Por supuesto, ambos factores pueden operar al mismo tiempo.
Algunas bacterias tienen fases estacionarias muy cortas y rápidamente empiezan
a morir. Otras permanecen en la fase estacionaria por semanas.
Una baja población, o un yacimiento, no son causas
de la fase estacionaria. Es más, los cultivos mixtos de ciertas especies logran
obtener poblaciones más grandes que los cultivos puros. Esto es a menudo una
sorpresa para los bacteriólogos que sólo trabajan con cultivos puros. Uno debe
acostumbrarse a la idea de que un cultivo de Escherichia coli se estabilizará en un periodo muy corto en una
población de 4 millones de células por mililitro y tendrá que pensar que esto
es válido para la mayoría de bacterias que pueden encontrarse en un medio de
cultivo. Los medios ambientes naturales, con grandes poblaciones bacterianas,
sobrepasan estas cifras considerablemente. Por ejemplo, el resumen presenta
cuantas de una mezcla de especies bacterianas en niveles que van desde los 30 a
los 60 millones por gramo.
Esto se entiende fácilmente si comprendemos que
las diversas especies tienen diferentes requerimientos para el crecimiento,
diferentes nutrimentos y diversas tolerancias a los factores ambientales. A
pesar de ocupar el mismo espacio, en general, cada especie vive su propio nicho
ecológico. No es enteramente independiente de otras especies, pero sí está
limitada en número por sus propias demandas nutricionales y a las reacciones
hacia los productos de desecho, y no por la competencia por el espacio físico
con las otras especies.
RELACIONES
MATEMÁTICAS:
“El
parámetro más importante del quimiostato es el ritmo de dilución o de
rebosamiento, que es el ritmo al que el medio fluye a través del sistema. El
ritmo de dilución determina el ritmo de división celular de la población, y
alterando el ritmo de flujo se puede alterar directa y rápidamente el ritmo de
crecimiento lo que hace del quimiosato un dispositivo tan útil. Cuando un
volumen de medio de cultivo ha pasado a través del quimiosato, la población se
ha doblado ya que la población celular ha continuado siendo la misma. El tiempo
de generación es pues el tiempo que necesita un volumen de medio de cultivo
para desplazarse a través del recipiente.” (5)
Sin embargo, el tiempo de generación en el
quimiostato no es exactamente el mismo tiempo de generación en un cultivo estático
con crecimiento exponencial. Ello es debido a que en el cultivo estático cada célula
formada se divide y produce una descendencia, mientras que en el quimiostato
algunas de las células son arrastradas antes de que puedan dividirse, de manera
que el ritmo real de división celular es mayor que el ritmo de población de células.
Debemos que distinguir entre el tiempo de generación en cultivo y el tiempo de
generación celular. En un cultivo estático con crecimiento exponencial el
tiempo de generación celular es equivalente al tiempo de generación del
cultivo y viene dado por 1/k. En un quimiostato, el tiempo de generación en
cultivo es la inversa del ritmo de crecimiento instantáneo de un cultivo, el
cual se expresa por la siguiente ecuación diferencial:
dx = μx
ó μ=
1 dx
(Ec. 10.7.2-2)
dt
x dt
Donde x es el número de células o la concentración
del organismo (miligramos de peso seco por mililitro) a un tiempo t, y μ es
el ritmo o velocidad de crecimiento instantáneo. Con la integración de la
ecuación anterior entre los límites xo y xt, se obtienen
la siguiente ecuación:
ln xt -ln xo
= μt
(Ec.
10.7.2-3)
o, como se expresa generalmente la solución,
xf = xo e μt
(Ec. 10.7.2-4)
Puesto que xf es también igual a 2kt
xo, la relación entre k y μ puede derivarse combinando las dos
ecuaciones:
xo
e μt = 2kt xo
(Ec. 10.7.2-5)
Suprimiendo los factores comunes, tomando logaritmo
natural y despejando μ, se obtiene:
μ = k(ln 2) = 0.693 k
(Ec. 10.7.2-6)
Así,
se puede calcular μ, el ritmo de crecimiento instantáneo para un
quimiostato, multiplicando k por 0.693.
Volviendo
al quimiostato, podemos ver que μ, el ritmo de crecimiento instantáneo, es
igual al ritmo de dilución, ya que el ritmo al que salen las células está
exactamente equilibrado con el ritmo de crecimiento. El ritmo de dilución se
expresa como el ritmo de flujo en mililitros por hora dividido por el volumen
del cultivo del quimiostato. Así, si el volumen es 500 ml y el ritmo de flujo
es 5 ml/h, el ritmo de dilución es 5/500 ó 0.01 por hora. Esto significa que
cada 100 horas el volumen del quimiostato sería repuesto y el ritmo de
crecimiento instantáneo sería 100 horas.
Para entender el principio por el cual la densidad
de población y el ritmo de crecimiento están controlados en el quimiostato,
debemos reconsiderar el efecto de la concentración de nutriente en el
crecimiento, expresado cualitativamente.
La relación entre μ y la concentración de un
nutriente limitante se describe empíricamente por la ecuación:
μ = μ max
s
(Ec. 10.7.2-7)
ks + s
Donde s es la concentración del sustrato, μ max
es el ritmo de crecimiento especifico máximo ( es decir, el valor máximo de
μ a niveles de saturación de sustrato) y k, es una constante de saturación,
numéricamente igual a la concentración de sustrato en la que μ = ½
μ max. La ecuación anterior es formalmente equivalente a la
ecuación de Michaelis-Menten utilizada en los
análisis enzimáticos cinéticos. Se pueden calcular los
parámetros desconocidos μ max y k, representando gráficamente
1/v sobre el eje y en función de 1/s sobre el eje x. Se obtendrá una línea
recta que intercepta el eje y, y el valor en el punto en que lo intercepta es 1/
μ max. La curva de la línea ks / μ max,
y puesto que μ max es conocido, se puede calcular ks.
En general, los valores de k, son muy bajos.
La relación entre el ritmo de crecimiento y el
ritmo de consumo de sustrato pueden expresarse como:
dx = Y ds
(Ec.10.7.2-8)
dt
dt
donde Y,
la constante de rendimiento, es:
Y = peso de las bacterias formadas
(Ec. 10.7.2-9)
Peso de sustrato
consumido
La clave del modo de acción del quimiostato es la
composición del medio del depósito. Todos los componentes de este medio se
hallan en exceso, excepto uno, el sustrato limitante del crecimiento. El símbolo
para la concentración de este sustrato en el depósito es SR,
mientras que el del mismo sustrato en el recipiente de cultivo es s. Tomando en
cuenta las ecuaciones anteriores, pueden hacerse las siguientes consideraciones.
Cuando un quimiostato es inoculado con un pequeño
número de bacterias y el ritmo de dilución no excede de un cierto valor crítico
(Dc), el número de organismos empezará a aumentar. El aumento es
dado por:
dx =
crecimiento – salida
(Ec. 10.7.2-10)
dt
o
bien:
dx = μx – Dx
(Ec. 10.7.2-11)
dt
Puesto
que inicialmente μ > D, dx/dt es positivo. Sin embargo, a medida que
aumenta la densidad de población decrece la concentración del sustrato
limitante del crecimiento, causando un descenso de μ. Si D se mantiene
constante, se alcanzará un estado de equilibrio en el que μ = D y dx/dt =
0.
Los
estados de equilibrio sólo son posibles cuando el ritmo de dilución no excede
de un valor crítico Dc. Este valor depende de la concentración del sustrato
limitante del crecimiento en el depósito (SR).
Dc = μ max (SR/ ks
+ SR)
(Ec. 10.7.2-12)
Así, cuando SR >> ks
(que es el caso general), pueden obtenerse estados de equilibrio a ritmos de
crecimiento cerca de μ max . El cambio en s viene dado por:
ds = SRD – sD – μx
(Ec. 10.7.2-13)
dt
Y
Cuando
se ha alcanzado un estado de equilibrio, ds/dt = 0
Un
estado de equilibrio se alcanza automáticamente cuando D < Dc.
A
partir de las ecuaciones 10.7.4-5 y 10.7.4-6 pueden calcularse los valores del
estado de equilibrio de la concentración de organismo (x*) y del sustrato
limitante del crecimiento (s*):
x* = Y (SR – s)
(Ec. 10.7.2-14)
s* = ks (D/ μ max – D)
(Ec. 10.7.2-15)
Estas ecuaciones, una vez que sus valores son
conocidos, los valores del estado de equilibrio de x* y s* pueden ser
determinados de antemano para cualquier ritmo de dilución. Como puede verse a
partir de la ecuación 10.7.4-8, la concentración de sustrato del estado de
equilibrio (s*) depende del ritmo de dilución (D) aplicado y es independiente
de la concentración del sustrato en el depósito (SR) . Así, D
determina s* y s* determina x*.
Como se ha visto, los límites dentro de los cuales
el ritmo de dilución controla el ritmo de crecimiento son muy amplios, aunque
tanto a ritmos de dilución muy bajos como muy altos se rompe el estado de
equilibrio. A elevados ritmos de dilución, cerca de Dc el organismo
no puede crecer bastante deprisa para mantener el mismo ritmo que la dilución,
y el cultivo sale del quimiostato. En el otro extremo, a ritmos de dilución muy
bajos, una fracción grande de células puede morir de inanición ya que el
nutriente limitante no es añadida con suficiente rapidez para permitir el
mantenimiento del metabolismo celular.
Probablemente,
hay una cantidad mínima de nutriente necesaria para mantener estructura y la
integridad celular, llamada energía de mantenimiento, y este nutriente no está
disponible para la biosíntesis ni para el crecimiento celular. Así, a ritmos
muy bajos de dilución es probable que no se mantengan las condiciones del
estado de equilibrio y la población será eliminada lentamente del quimiostato.
La densidad celular en el quimiostato es controlada
por el nivel del nutriente limitante. Si la concentración de este nutriente en
el medio que entra es aumentada, permaneciendo constante el ritmo de dilución,
la densidad celular aumentará aunque el ritmo de crecimiento continuará siendo
el mismo. Así, pues, ajustando el ritmo de dilución y el nivel de nutriente,
el experimentador puede obtener a voluntad una variedad de densidades de población
de diversos ritmos de crecimiento.
10.7.3.
RAPIDEZ
CINÉTICA DE DILUCIÓN:
De
la cinética se conoce que uno de los modelos más ampliamente aceptados en
Enzimología es el de Michaelis-Menton, quienes han propuesto una ecuación para
ligar la velocidad de formación de producto,
con la máxima velocidad de producción, V, con la concentración del
sustrato, S, y con la constante de Michaelis-Menten (que a su vez relaciona la
constante de equilibrio de la disociación del complejo enzima-sustrato con las
constantes de velocidad de formación de producto y de formación del complejo
enzima-sustrato) km:
ν = VS/(km + S)
(Ec.10.7.3-1)
En
los procesos de Biomasa, el producto de la fermentación es precisamente la masa
molecular, en consecuencia ν es equivalente a la velocidad de crecimiento
específico μ, h –1, y V equivalente a μ max
de tal manera que el modelo propuesto por Monod es el siguiente:
μ = μ max
S/(Ks
+ S)
(Ec. 10.7.3-2)
Donde
Ks es la constante de
saturación, g/l y numéricamente es igual a S para cuando μ = ½ μ max.
10.7.4
PRODUCTIVIDAD:
Los cultivos continuos tienen cierta ventaja con
relación a los cultivos por lotes. Pueden operar por largos períodos de tiempo
y tener niveles de crecimiento constantes, la productividad puede ser mayor, en
comparación al método por lotes, se maximiza la conversión y se reducen los
problemas de inhibición del sustrato por el mantenimiento de sustrato residual
de baja concentración.
También tiene inconvenientes, lo cual consiste en
la sofisticación técnica y control, costo de instalación inicial alto debido
al suministro continuo de nutrientes estériles y la continua separación de
productos.
10.7.5
DETERMINACIÓN
DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS Y DE RENDIMIENTO:
Se sugiere que cuando el crecimiento se realiza a
gran velocidad y cuando la concentración de sustrato es alta, se pueden
considerar las siguientes relaciones:
Y = -dx
(Ec. 10.7.5-1)
ds
o lo que es lo mismo
dx = Y ds
(Ec. 10.7.5-2)
dt
dt
Sin embargo hay ocasiones que el sustrato se
consume también en “mantenimiento del sistema”, tal es el caso de la
glucosa que puede emplear un microorganismo para respirar pero no para la
multiplicación. Por este motivo a bajas concentraciones la expresión de
rendimiento debe incluir un factor que contabilice el sustrato limitante que se
consume en “mantenimiento” y la ecuación sugerida es la siguiente:
rx + dx
=- Y ds
(Ec.
10.7.5-3)
dt
dt
donde :
r = requerimiento, para mantenimiento específico
de sustrato limitante por unidad de masa molecular.
10.7.6
DESVIACIONES
DE LA CONDUCTA IDEAL DEL QUIMIOSTATO:
Monod
encontró que cuando se opera con el “Quimiostato” y existe un solo sustrato
limitante, tiene vigencia satisfactoria un modelo muy simple que se parece al
modelo de Michaelis-Menten de la cinética enzimática. El sustrato limitante se
caracteriza porque al modificar su concentración se afecta a la formación de
productos. Al consumo de sustrato por el microorganismo, y al crecimiento mismo
del microorganismo. El modelo propuesto por Menod ha sido comprobado
experimentalmente razón por la que tiene mucha aceptación. Con este modelo se
describen muy satisfactoriamente los procesos de Biomasa de tal manera que se
utiliza como criterio de diseño en Fermentación Continua.
10.7.7
MODIFICACIONES
A LA TEORÍA BÁSICA DEL QUIMIOSTATO:
Cuando X aumenta.- Considerando las ecuaciones
anteriores, se observa que al aumentar X, la concentración de sustrato S tiene
que disminuir, lo cual implica que μ debe disminuir. Lo que se ha asumido
significa que, S ≠ 0. Pero la disminución de μ a su vez implica un efecto contrario al supuesto al
principio.
Cuando X disminuye. Implica también que S
≠ 0.
Al
disminuirse la concentración de
microorganismos aumenta la concentración de sustrato S, por lo que debe
aumentar μ con lo que se produce el efecto contrario al que se supuso.
Cuando
aumenta F. Considerando que el factor de dilución D es la relación entre
caudal de alimentación y el volumen de sustrato fermentescible y debiendo
permanecer V constante en razón de o asumido para definir el Quimiostato, el único
parámetro de operación es F.
F = VD
(Ec.
10.7.7-1)
Esto
es que al aumentar el caudal F, aumenta el factor de dilución D provocándose
el “lavado” del reactor, es decir hay disminución de la concentración
celular X.
De
los análisis realizados se puede concluir que es conveniente que la concentración
del sustrato de salida S sea lo más bajo posible, pero en cambio que la
velocidad de reproducción o de crecimiento del microorganismo X sea lo más
alto posible. Sin embargo se debe también puntualizar que:
Ø
Si el sustrato es barato puede lograrse la máxima
conversión lo cual permite trabajar con valores de D correspondientes al máximo
valor X
Ø
Si el sustrato es costoso, no se puede trabajar con
el factor de dilución D demasiado alto con lo que X es menor que el valor óptimo.
10.7.8
VENTAJAS
DEL CULTIVO CONTINUO SOBRE EL CULTIVO POR LOTES:
Las
ventajas de este tipo de cultivo se las puede enumerar de la siguiente manera:
Ø
Opera por periodos largos; tiempos muertos bajos
Ø
Costos de operación y trabajo bajos
Ø
El cultivo se mantiene con coeficientes de
crecimiento constantes
Ø
Crecimiento balanceado, composición celular
constante
Ø
Generación de biomasa constante como productividad
y conversión
Ø
Volumen de reactor reducido en comparación a la
productividad similar en proceso por lotes
10.7.9
DESVENTAJAS
DEL CULTIVO CONTINUO SOBRE EL CULTIVO POR LOTES:
Las
desventajas de este tipo de cultivo se las puede enumerar de la siguiente
manera:
Ø
Alto costo por alta calidad de equipos y accesorios
Ø
Requiere gran reservorio para almacenamiento de MÉDIUM
o suministro continuado de sustrato.
Ø
Esterilización continuada, separación continuada
de producto y niveles de purificación
Ø
Biosensores sofisticados y automatización
computarizada para operación óptima
Ø
Se incrementa el riesgo de contaminación debido a
la amplia operación
Ø
Posibilidad de mutación, incremento de FAGOS por
los cambios genéticos debido a la presencia de plasmidios e incremento de estos
Ø
La conversión total de sustrato exige sistema de
multiniveles, inmovilización celular o recirculación celular que encarece el
costo de operación.
10.8
APLICACIONES DEL CULTIVO
CONTINUO:
En todos los sistemas de cultivo continuo las
densidades de población son mantenidas a niveles considerablemente bajos que
los que se presentan en la fase estacionaria del crecimiento. El tipo más
simple de sistema de cultivo continuo que hay que comprender es el llamado
turbidostato. En este sistema la turbidez del cultivo es medida fotoeléctricamente
y la señal eléctrica se utiliza para controlar una bomba que añade medio de
cultivo a fin de diluir el cultivo a un ritmo justamente suficiente para
equilibrar el aumento de turbidez debido al crecimiento. El dispositivo está
ajustado de tal modo que una turbidez determinada puede ser mantenida
indefinidamente. Si se desea poca turbidez, el medio se añade más rápidamente,
mientras que si se desea un alto grado de turbidez el medio se añade más
lentamente. El medio utilizado contiene todos los nutrientes esenciales en
exceso, de forma que la población crece en una manera similar a la fase
exponencial. En el turbidostato el ritmo de crecimiento no es controlado por el
investigador, sino por condiciones internas del sistema tales como las
condiciones ambientales utilizadas, la especie de organismo y el medio.
Los turbidostatos son dispositivos útiles para
proporcionar aportaciones continuas de células en estados fisiológicamente
controlados, y pueden ser especialmente importantes en la microbiología
industrial, campo en el que los procesos de producción continua suelen ser más
económicos.
En otro tipo de dispositivo de cultivo continuo, el
quimiostato, tanto la densidad de población como el ritmo de crecimiento son
controlados por el investigador. Para la regulación del quimiostato se utilizan
dos elementos: el ritmo de flujo y la concentración de un nutriente limitante,
como una fuente de carbono, de energía o de nitrógeno, o factor de
crecimiento.
CONCLUSIONES:
1.
El cálculo del número de células
que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento
celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del
nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad
bioquímica con relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se
clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos.
2.
El
peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran
en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C
hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra,
debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un
gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles
de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación.
También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado,
principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
3.
Los métodos
de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden
llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso
seco (contenido macromolecular).
4.
El
crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes
perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la
capacidad para multiplicarse que tienen las células individuales, esto es
iniciar y completar una división celular.
5.
Todos
los microorganismos tienen una temperatura óptima de crecimiento. Esto
significa que a determinada temperatura la velocidad de duplicación (o la
velocidad de crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor. Hay que
tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el mismo rango de
temperaturas.
6.
El efecto de
la concentración del nutriente sobre el crecimiento total es fácil de
comprender, ya que gran parte del nutriente se convierte en material celular, y
por tanto, si se limita la cantidad de nutriente se convierte en material
celular. La razón del efecto de las concentraciones muy bajas de nutriente
sobre el ritmo de crecimiento es más incierta. Una opinión es que a estas
bajas concentraciones de nutriente éste no puede ser transportado a la célula
a una velocidad suficiente para satisfacer todas las demandas metabólicas de
nutriente. Es presumible que no todos los lugares transportadores están
ocupados. Esta propiedad de alterar el ritmo de crecimiento mediante la
concentración del nutriente se utiliza en el aparato de cultivo continuo
llamado quimiostato.
APLICACIONES:
El conocimiento de la
cinética de crecimiento de los microorganismos es de sumo interés en el campo
industrial, ya que permite conocer la manera de reproducción de las bacterias,
permitiendo desarrollar métodos de catalización e inhibición de éstos y de
prevención en caso de que el crecimiento sea en una forma desproporcionada y
peligrosa. Además este conocimiento ayuda en diferentes campos, como por
ejemplo, el alimenticio, en el cual el conocimiento de la cinética de
crecimiento microbiano es un parámetro que indica la forma en que se deben
colocar los preservantes en un producto determinado. En general las aplicaciones
de éste tema son innumerables y ya se han detallado con bastante amplitud en
puntos anteriores.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
CITAS BIBLIOGRÁFICAS:
(1)
VARIOS,
“Los Microorganismos”, ed. Círculo de Lectores, cuarta edición, Barcelona,
1998, p.576.
(2)
Idem (1), p. 587.
(3)
Idem (1), p. 592.
(4)
VARIOS,
“Enciclopedia Autodidáctica”, tomo III,
ed. Quillet, primera edición, Barcelona, 1999, p. 349.
(5)
Idem
(4), p. 355.
BIBLIOGRAFÍA:
Aurelio Hernández
Muñoz, “Microbiología”, Editorial Paraninfo,
Madrid, 1997.
VARIOS,
“Enciclopedia Autodidáctica”, Editorial Quillet, Barcelona, 1998.
VARIOS,
“Los Microorganismos”, ed. Círculo Lectores, 4ta edición, Barcelona, 1998
Url
http://www.promusmex.com
http://www.geocities.com
http://www.monografía.com
http://www.microbiología.com
http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm
http://www.uib.es/depart/dba/microcore/
Arias Edison - Lastra Jorge
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