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Tecnicas de separacion. Aplicaciones


Enviado por Teresa Fernández Aldama y Otros
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Resumen: Metodos de separacion. Introduccion. Los metodos cromatograficos. Electroforesis Convencional. Electroforesis Capilar (CE).


   

  

Indice
1. Métodos de separación.Introducción
2. Los métodos cromatográficos
3. Electroforesis Convencional
4. Electroforesis Capilar (CE)
5. Bibliografía

1. Métodos de separación. Introducción

Desde el siglo pasado las separacionesanalíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación,destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre lacomposición y función de las proteínas han obligado a los científicos abuscar técnicas, cada vez, más precisas.
Para elegir una técnica de separarción, además de tener en cuenta loscriterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos deconsideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas yestructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las característicasde la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis(sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detecciónespecífica).
El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención,preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnicaanalítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse endos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Lastécnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, unainformación compleja, relacionada con sus características estructurales específicas,por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver loscomponentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticoscuantitativos o cualitativos.
Es precisamente en las técnicas de separación en las que basaremos la revisiónbibilográfica del presente trabajo, debido a su amplio uso en el campo de laBiotecnología, Biología Molecular y Bioquímica entre otras ramas de lainvestigación.
Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente porcromatografía y electroforesis.
La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos quepermite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados enmezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otrosmedios. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masasmoleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potencialesredox, etc.
La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de unamezcla, sino también su identificación y cuantificación. El análisiscualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos yvolúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado enla medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con laconcentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña,constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de lacolumna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil,que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. La fase móvilpuede pasarse a través de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y quese fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen deforma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entrela fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertementeretenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fasemóvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la faseestacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad,los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que puedenanalizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se recogen enforma de gráficos llamados cromatogramas.
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que lafase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografíade columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cualse hace pasar la fase móvil por presión. En la cromatografía en plano, lafase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de unpapel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionariapor capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografíade líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos.Como su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gasy fluido supercrítico respectivamente.
Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna osobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidossupercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal maneraque las paredes de la columna contienen la fase móvil.
La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLCpor su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativasexactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábilesy su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como sonlos aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,entre otros. Se ofrece a continuación un esquema relativo a este método deseparación:

2. Los métodos cromatográficos

La cromatografía líquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:

  • C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad
  • C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción
  • C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular
  • C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica

Cromatografía de reparto
La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquidoy la cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en laforma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporterelleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria seune químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es másusada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de unrecubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida dela fase estacionaria por disolución en la fase móvil.
En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamentese preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elementobásico. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamenteresistentes, porosas y uniformes.
Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente seclasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácterno polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionalespolares.
Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantesartificiales, antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.

Cromatografía De Adsorción
La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de lacromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la hanconvertido en un método importante de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílicey la alúmina, siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas molecularesinferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y repartotienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.
En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras queson solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada endisoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto enfase inversa. En este tipo de cromatografía también se pueden separarcompuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular deeste método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.

Cromatografía De Exclusión
La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel ocromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de penetraciónde las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separaciónobtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de elución esproporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con loscompuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difierede las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicaso químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnicareproducible, escalable y rápida.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice quecontienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculasde pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente yson eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen accesoa todo el volúmen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduceque el volúmen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para lasgrandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. Enresumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamañodel poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución.
Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente,tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Loscompuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa(Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Haydiferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolucióny menor gasto en la columna.
Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos,determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

Cromatografía De Intercambio Iónico
La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entreiones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En elcaso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la faseestacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicoscontienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.
Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles.Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas,en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 ypierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos deamonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicosdébiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicasy pierden entonces su capacidad.
Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios dondeintervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeñosde la resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes quelas macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazarirreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónicode macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculasgrandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigencondiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.
En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a lasdiferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de unasustancia.
Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria através de la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismode inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentescomponentes separados.
La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco ArneTiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en estaesfera.
La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinéticobasada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en undeterminado medio (solución tampón de electroforesis), a través de una matrizo soporte reticulado como resultado de la acción de un campo eléctrico. Elcomportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética y éstapor la carga, tamaño y forma de la misma. Cuanto mayor es la relacióncarga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico.
Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas deinterés en la industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útilpara la separación de proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA yRNA) con gran resolución.
En un sistema electroforético pueden originarse distintos fenómenos queafectan la separación de las sustancias:

  • Difusión

Este fenómeno es provocado por la existencia de gradientes de concentaciónque favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentaración de cadaespecie. Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculastienden a moverse de una forma aleatoria debido a que poseen energía cinéticapropia. Esto es lo que se denomina difusión. Con un aumento de la temperaturaaumentará la difusión por un incremento de la energía cinética.

  • Migración

Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio,en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.

  • Flujo térmico

Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina unaresistencia dada, se produce calor. Por tanto el sistema electroforético no esisotérmico. En general la fase líquida se mueve hacia las zonas de menortemperatura, lo que origina un transporte de las partículas de interés nodebido a la migración.

  • Fricción

La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverselos solutos chocarán con las moléculas del solvente que están en su camino),lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.
La suma de todos estos factores provoca que las moléculas no migren de unamanera uniforme, de modo que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugarde la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchuraaumentará con el tiempo. Para reducir esta anchura podemos reducir elmovimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia adicho movimiento.
Esta situación nos permite diferenciar dos métodos electroforéticos:

  • Electroforesis convencional
  • Electroforesis capilar.

3. Electroforesis Convencional

La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años paraseparar especies complejas de elevado peso molecular de interés biológico ybioquímico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana oplaca de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en elinterior de sus poros. Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistenciaal movimiento de las moléculas, controlando así su migración uniforme.
Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente.Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corrientecontinua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones sehan completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñenpara visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza,caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así comopreparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculasy fragmentos de DNA y RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificadosque tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes depolímeros no solo reprimen la convección sino que también actúan como cribasque pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricosmás grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a travésde la estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dosmecanismos de separación: electroforesis, que separa por la relacióncarga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles máscomunes son agarosa y poliacrilamida.
La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a supoder de gelificación y propiedades físico-químicas, lo han convertido en elsoporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular. Lapoiliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N´metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos define el grado dereticulación del gel.
Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamentelibres de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la disolucióntampón se desplace por el gel cuando se active el campo eléctrico.
A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios pararealizar esta técnica de separación:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica,aspecto este que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados quese encuentran en la literatura más actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en gelesdesnaturalizantes de agarosa, electroforesis en campo pulsado y laelectroforesis preparativa. Estas técnicas no son de aplicación tan generalpero no por ello dejan de ser importantes.

4. Electroforesis Capilar (CE)

La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesisconvencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución delos compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Estaafirmación no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe unadependencia directa de éste con el campo eléctrico. Esto se debe a que elcalentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separación. Parasolucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubocapilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1m. Esta técnica está representada en el siguiente esquema:
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de losanalitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entreotras sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que dalugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis convencional en la cual seemplean volúmenes de muestra en el orden de los µL, con una elevada resolucióny rapidez. Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la cromatografía líquidade alta resolución (HPLC).
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad delos mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría conmuy baja concentración iónica, incorpora los principios de la automatizacióna través de un hardware creado especialmente con un software altamenteoptimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se puedenutilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado seobtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuestoseparado. En realidad ambas técnicas son complementarias al basarse enmecanismos de separación diferentes.

Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con lacromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migraciónelectroforética y también en función del peso molecular de las muestras. Selleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poroscontienen una mezcla tampón donde ocurre la separación. Estos geles estáncontenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son también de agarosa ypoliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y másutilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación.Está basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona deseparación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicosde la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonasque puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre laszonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principalinconveniente es que no permite separar los compuestos neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínasse aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este métodose basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel. Estegradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitosque migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuandoal gradiente de pH se le introduce una proteína, cada zona intercambia protonescon la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica conocida comoelectroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significaque el tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas esindependiente de la velocidad. Es una técnica de separación pordesplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito lídero guía en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor quela de los componentes a separar. Luego se introduce la muestra seguida delelectrolito terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de loscomponentes de la muestra. La selección de los electrolitos guías y terminalesdepende del conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todoslos componentes de la muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zonaadyacente. Esta característica es necesaria para mantener la continuidad eléctricaa lo largo del sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Serequiere usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde sereúnen algunas de las mejores características de cada técnica por separado,por lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografíacapilar puede usarse para la separación de especies no cargadas. Proporcionauna elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución demuestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presión.
En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de lafase estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no porun bombeo mecánico, lo que simplifica significativamente el equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar:

  • Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno.
  • Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interacción de las micelas y los solutos es la que produce la separación.

En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicasampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en laindustria biotecnológica, biológica y bioquímica. Muestra de ello es elnumeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literaturaespecializada.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar.Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta másventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para elestudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estosaspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.

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Palabras clave: métodos de separación, cromatografía, electroforesis

 

Trabajo enviado por:
Teresa Fernández Aldama
teresa.fernandez@umcc.cu,teresa1925@hotmail.com
Marcelo Marcet Sánchez
marcelo.marcet@umcc.cu,marcet@infomed.sld.cu
Carlos Martin Medina
carlos.martin@umcc.cu,carlosmartin63@yahoo.com
Eugenio Carrillo Prieto
eugenio.carrillo@umcc.cu,eugeniocarrillo2001@hotmail.com


Enviado por Teresa Fernández Aldama y Otros
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Publicado Friday 15 de August de 2003