Introducción
Para algunos autores no existe una sustancia mas importante que el ADN. Estaidea se basa ppalmente en 3 postulados:
¨ El primero indica que el ADN contiene dentro de su molécula lainformación que determina la estructura de proteínas generadoras universalesde las funciones celulares.
¨ El segundo indica que el ADN tiene la capacidad de transmitir estainformación en forma hereditaria.
¨ El tercer postulado indica que esta molécula ha dado la base detodos los procesos evolutivos que han generado los miles de millones diferentesde formas de vida que ocupan la tierra desde la existencia de las primerasformas de vida hace 3 o 4 mil millones de años.
El conjunto de instrucciones genéticas esta ubicado en el llamado genoma: elADN que codifica estas instrucciones junto con proteínas necesarias paraejercer su función forman los denominados cromosomas.
Todas las formas de vida están constituidas por células, que soncompartimientos cerrados por una membrana y llenos de soluciones de elementos denaturaleza química.
El bagaje genético esta organizado en cromosomas, los cuales estáncompuestos por ADN y proteínas en estructuras fuertemente comprimidas.
Cada cromosoma esta compuesto por miles de genes, las zonas funciones del ADNy por otras zonas no codificantes. Cada gen es la unidad funcional mas pequeñay contiene la información para la síntesis de una proteina.
La función de generar un organismo ha sido asignada a las célulasgerminales. Estas son capaces de reducir el numero de cromosomas a la mitad poruna división celular llamada meiosis. Los productos de la meiosis son célulashaploides llamadas gametas. Estas células presentan una sola copia de loscromosomas autosomicos y uno de los cromosomas sexuales.
Las gametas se combinan para formar una célula única diploide con capacidadpara generar 10 billones de células constituyentes del organismo.
La división celular de estas células somáticas mediante los procesos demitosis aseguran la transmisión de la información genética existente en elADN.
La unidad de un tejido es la célula, de tal manera que en el malfuncionamiento de las células de un tejido da lugar al mal funcionamiento delórgano al cual pertenece dicho tejido.
Ciclo Celular
Cada célula esta capacitada para duplicar su material genético, mediante laduplicación del ADN, y luego dividirse para formar células hijas. Estas mismascélulas a su vez tienen la capacidad de generar la formación de proteínastambién a partir del ADN. Estos procesos denominados duplicación de ADN oduplicación del material genético y transcripción o generación delintermediario (ARN) para la síntesis de proteínas se realiza en etapas delciclo denominado Ciclo Celular.
Se denomina ciclo celular al conjunto de etapas que sigue la célula durantesu crecimiento y división.
La mayoría de los componentes de una célula se sintetizan durante laInterfase. Este es el periodo entre divisiones y ocupa el 90% del ciclo. Laprimera parte de la interfase se denomina G1, proviene de gap quesignifica interrupción o suspensión de la continuidad (en este caso primerainterrupción), le sigue la fase S, en la cual hay síntesis de ADN y G2o segunda interrupción. En G1 hay un crecimiento rápido con unagran actividad metabólica, que incluye síntesis de ARN y de proteínas. Elperiodo de crecimiento celular continua en la fase S y es aquí cuando seduplica el ADN. En la fase G2 la célula continua su crecimiento yprepara la célula para su división. La división celular en si misma, o sea, la mitosis se conoce como fase M. Las células que no sedividen por periodos largos de tiempo, no tienen duplicación de ADN y se lasconsidera en periodo de reposo, o sea en periodo G0. Los oncogenesactúan acelerando la velocidad de crecimiento celular en la fase G1y pueden llegar a provocar que la célula proceda a una mitosis en vez de haciala fase G0. los genes supresores de tumor pueden actuar como señalesde freno en G1 para frenar o desacelerar el ciclo celular antes de lafase S. A lo largo de todo ciclo celular los genes que codifican para enzimasreparadoras de ADN pueden estar activos, y particularmente lo están en la faseG2 después de laduplicación de ADN, antes que los cromosomas estén listos para la mitosis.
Esquema del Ciclo Celular
La programación de las células eucariotas a través del ciclo celular estagobernada por una formación, Activacion y desactivación de un complejo enzimáticode proteínas quinasas denominadas ciclinas (cdk).
Las entradas a las diferentes fases o etapas del ciclo celular esta reguladapor la Activacion y también por la regulación negativa del complejo cdk. Estaregulación tiene principalmente un fin, que no se prosiga en el ciclo sin habersido completada la fase correspondiente produciéndose todos los eventosmoleculares necesarios. A estos ptos de regulación se los denomina “checkpoints”. Dentro de estos, uno de los mas estudiados y documentados es aquelque monitorea la terminación de la síntesis de ADN y la formación del husofuncional actuando en la transición de G2 a M y en la salida de lamitosis. Por ejemplo, en algunos sistemas cuando el ADN no esta replicado seinhibe la Activacion del complejo cdk por inhibición de la defosforilacion deuna proteina quinasas la ciclina b-cdk2. Esta quinasa cuando esta fosforilada enuna tirosina en la posición 15 activa el complejo y regula la transición de lafase G2 a M.
Este mecanismo de regulación negativa requiere la Activacion de varios genesque finalmente dan lugar a la Activacion de una quinasa denominada Wee 1- MlK-1,la cual es la encargada de mantener fosforilada la tirosina.
Existen check points en las etapas tempranas del ciclo celular que controlanla entrada a la fase S.
Todos estos eventos están regulados por la acción de factores de origenproteico actuando a través de sus receptores de membrana. Hay diversos factoresque interviene, entre los que se encuentran los factores de crecimiento y lasCitoquinas. Podemos definir a los factores de crecimiento como polipéptidos queestimulan o inhiben la proliferación celular, en tanto que las citoquinas sonreguladoras de la inflamación y la rta inmune. Ambos actúan a través dereceptores de membrana de alta afinidad. Muchos factores de crecimiento tambiéntienen efecto en migración celular, formación de la matriz, diferenciación yapoptosis.
Un numero elevado de factores de crecimiento entre los cuales se encuentranel EFG, factor de crecimiento fibroblastico (FGF), PDGF, factor de crecimientode macrófagos (CSF) y los factores de crecimiento insulino-símiles estimulanla mitosis celular por interacción con receptores de membrana.
La mayoría de los factores de crecimiento cumplen su función modificando laactividad de enzimas por reacciones de fosfo-desfosforilacion.
El receptor de insulina tiene actividad de tirosina quinasa. O sea que laprimera fosforilación en elmecanismo de acción de los factores de crecimiento es la fosforilación entirosina de enzimas. Esta fosforilación iniciara la cascada de eventos que danlugar a la regulación del complejo enzimático de las ciclinas.
Los receptores presentan en su constitución proteica un domino extracelularque reconoce a los factores de crecimiento que esta ligado por un dominioorientado de citoplasma a otro dominio que posee el sitio catalítico de laactividad de tirosina quinasa. En esta flia de receptores se pueden distinguir 3tipos. El receptor tipo I tiene como representante al EGF. En el tipo II estánpresentados los factores de crecimiento insulino-símiles y en los del grupo IIIPDGF y los oncogenes c-fms que codificarían proteínas relacionadas a estereceptor.
Estos receptores son componentes claves para el control del crecimiento ydiferenciación celular por su habilidad de generar señales mitogenicas. A suvez estas señales proporcionan y están encuadradas como llaves para elentendimiento de los procesos de transformación celular. Por ejemplo, unincremento en la expresión de una subclase de receptores para factores decrecimiento con actividad de tirosina quinasa, debido a una amplificación debenla expresión de su gen, da como resultado el crecimiento de células malignasaun en humanos.
El mecanismo exacto por el cual los factores de crecimiento pueden regular elcrecimiento y diferenciación celular es motivo de numerosas investigaciones.Dentro de estas hipótesis existe la regulación de la fosforilación de unaproteina ribosomal denominada S6 como uno de los probables gatillos para que seproduzca la iniciación de la síntesis de ADN.
El/los mecanismo/s de acción de factores de crecimiento/citoquinas en laestimulación de la proliferación celular es muy compleja. La mayoría se une areceptores transmembrana que tienen actividad de tirosina quinasa en algúndominio o se une a una tirosina quinasa Src-símil como Jak o Tyk. Cuando elfactor se une al receptor produce una transfosforilacion del receptor entirosina. Esta tirosina fosforilada sirve de soporte a enzimas citosolicas o moléculasadaptadoras las cuales a su vez se fosforilan en tirosinas y se activandesencadenando mecanismo de señales de transducción para cambios en formacelular, diferenciación oproliferación. Los pasos de proliferación pueden incluir moléculasadaptadoras como Shc o Grb2, las cuales producen un incremento en el GTP unido a Ras, Activacion de Raf y estimulación de lacascada de quinasa de serina-treonina MAP, la cual culmina con la fosforilaciónde factores de transcripción.
Un mecanismo alternativo incluye la fosforilación de factores de transcripciónpor receptores e involucra la fosforilación de STAT (transductores de señalesy activadores de transcripción). Las proteínas STAT se conoce que una vezfosforiladas migran al núcleo para unirse al factor de transcripción “secuencias activada gamma” (GAS); este mecanismo, muy complejo de señalesinicia el ciclo celular muy temprano en la fase G1, para avanzar en la progresióndel ciclo celular siendo regulado por las CDKs.
La ausencia de estos factores de crecimiento hace que las células sedetengan en la fase temprana de G1 llamada también G0. Elfactor inhibidor del crecimiento denominado TGF beta o “growth inhibitiontransforming factor” inhibe la entrada de las células a la fase G1.Este factor trabajando también a través de la Activacion de receptores demembrana genera las señales necesarias para inhibir la Activacion del complejociclina o “ciclin complex”. Este mecanismo se produce por la inhibición dela expresión de una de las enzimas del complejo denominada cdk4.
Existe otra proteina denominada Cip 1 que inhibe el complejo cyclin-cdk, quees inducida por otra proteina denominada p53 a cuyo gen se lo denomina “gensupresor”.
De este modo, la maquinaria para el ciclo celular es un pto de convergenciaintracelular de señales de crecimiento en la fase G1. Una veziniciada la cascada de señales de transducción por los receptores tirosinaquinasa, progresa la acción, controlada ahora por las CDKs.
Estas CDKs están presentes en todo el ciclo celular y su actividad esregulada por ciclinas que las activan y por inhibidores de CDKs. Las ciclinasCDKs e inhibidores de CDKs son responsables de la regulación de la progresiónde G1 a S del ciclo celular.
La ciclina tipo D se expresa en la fase media de G1 y une CDKs; una vezfosforilado este complejo holoenzimatico por CAK (quinasa activadora de CDK) seactiva para fosforilar otras proteínas incluyendo Rb. La ciclina D1 es idénticaa los oncogenes bc11 y PRAD1. La ciclina D2 se comprobó su identidad con eloncogen Vin-1. La ciclina E se expresa en la fase G1 tardía, uneCDK2 la cual es activada por CAK y fosforila Rb (Rb es el gen supresor deretinoblastoma).
Los inhibidores de CDK son reguladores importantes de la actividad de CDK2 yCDK4. Otras proteínas (INK4, p16MTSI/INK4A y p15MTS2/INK4B)representan genes supresores de tumor que están deleccionados en muchoscanceres e inhiben el complejo ciclina D-CDK2. otros inhibidores de CDK tienenuna especificidad muy amplia inhibiendo la actividad de ambos complejos deciclinas: D-CDK4 y E-CDK2; estos son p21WAF1/CIP1, que se induce porel gen supresor de tumor p53 como rta al daño de ADN, y p27KIP1. Hasido demostrado que Rb es un blanco estratégico de señales regulatorias quegobiernan la transición G1/Sen muchos tipos celulares. Cuando Rb se encuentra como proteina no fosforiladaen G1 es activa como supresora de crecimiento y esta actividad estavinculada a su capacidad de unir proteínas de la familia del factor detranscripción E2F. En la fase G1 tardía la pRb estahiperfosforilada y se libera E2F, lo cual activa la transcripción de genes quese requieren para la transición G1/S, y para la síntesis de ADN.Además de pRb hay otras 2 proteínas pRb-símiles, p107 y p130, recientementeidentificadas que también regularían el crecimiento durante la fase G1y son blanco de fosforilaciones especificas en el ciclo celular por quinasadependientes de ciclinas.
Estos reguladores nucleares de la progresión del ciclo celular sonpotenciales puntos clave para una terapéutica en cáncer. Todos estos puntos decontrol del ciclo son importantes para el mantenimiento de la integridadgenomica. Estos genes integran un sensor de las condiciones del entorno para unaadecuada rta ante un daño en el ADN; estos mecanismo están frecuentementedeteriorados en células cancerigenas y se manifiesta como la alta inestabilidadgenomica que presentan. Aunque esta inestabilidad genomica no necesariamentesignifica que se generaran estos eventos malignizantes, sí incrementa mucho laposibilidad de que ocurran , a través de inactivacion de genes supresores y dela Activacion de oncogenes, ya que la malignizacion celular es un proceso demuchos pasos que da lugar a una gran heterogeneidad celular.
Si bien las células mamíferas tienen muchos mecanismo para mantener laintegridad genética, cuando se alteran estos pasos en cáncer da lugar a lasmetástasis y resistencia a lasdrogas. Estos fenómenos se inician cuando la célula sufre un daño en su ADNya sea provocado por procesos endogenos o exógenos, lo cual altera suestructura, la progresión del ciclo celular se frena mientras el daño del ADNse repara o la célula es eliminada por apoptosis. En las células en las cualeshay mutaciones que alteran los pasos de detección, reparación o rta al dañode ADN, el ciclo celular no se frena, se producen alteraciones cromosomicas queactivan oncogenes o inactivan genes supresores de tumores.
Estructura y Función del ADN
Cada molécula de ADN contiene dos cadenas de nucleótidos, compuestos de unazúcar (desoxirribosa), grupo fosfato y 4 bases nitrogenadas: A, C, T y G.
Una cadena de ADN se forma por la union de los nucleótidos en formacovalente y se realiza entre el OH del azúcar y el grupo fosfato una unionfosfodiester.
Las dos cadenas se complementan entre si como imágenes espejo y seencuentran interaccionando entre ellas por enlaces pte de H que son uniones nocovalentes. (C-G y A-T).
Se puede decir entonces que el ADN esta formado por dos polímeros de nucleótidos,cada uno formado por uniones covalentes de nucleótidos. Estos polímeros estaunidos entre si por uniones nocovalentes enfrentándose en forma de imagen especular.
La estructura final del ADN fue conocida en 1953 por Watson y Crick, quienesdiseñaron el modelo tridimensional del ADN que es aceptado actualmente.
Este modelo propone que el azúcar y el grupo fosfato están mirando haciafuera de la estructura tridimensional de doble hélice y las bases hacia adentrode ella.
La secuencia completa de ADN en todos los cromosomas de una especie sedenomina genoma. El genoma humano normal se compone por 23 pares de cromosomas:22 pares autosomicos y un par de cromosomas sexuales (X e Y).
La parte central del cromosoma se denomina centrómero y separa los dosbrazos: el corto denominado p y el largo denominado q.
Durante la gametogenesis las células diploides producen células haploides através de dos divisiones celulares especiales en un proceso denominado meiosis.Cada célula germinal haploide que resulta de la meiosis contiene uno de cadauno de los 22 pares de cromosomas autosomicos y un cromosoma X o Y. En lafertilización se fusionan un espermatozoide y un ovocito para formar una céluladiploide normal. La cigota se replica en sucesivas divisiones mitóticas, en lascuales todos los cromosomas son replicados en cada una de las células de ladescendencia, por esto si una mutación esta presente en el espermatozoide o enel ovocito que dieron lugar la célula cigota, cada célula de nuevo ser contendrá esa mutación. En este fenómeno se basa la transmisión demutaciones que predisponen a enfermedades hereditarias. Es importante comprenderque un gen puede tener distintas formas o variaciones en su secuencia de ADN enlos individuos de una población. Esas formas o variantes del mismo gen sellaman alelos.
En la meiosis los pares de cromosomas se separan, de modo tal que un óvulo oun espermatozoide tiene solo un alelo de cada par. Cuando las dos célulasgerminales se fusionan, la descendencia tendrá dos copias para cada alelo. Sila descendencia hereda dos alelos del mismo tipo, se la considera homocigotapara ese alelo, si en cambio, los alelos heredados son distintos se la consideraheterocigota para ese alelo. Esta herencia de genes se la conoce como segregaciónalelica.
Duplicación del ADN
La duplicación del ADN es un proceso que se realiza antes de la divisióncelular e involucra la polimerización de los diferentes nucleótidos.
Esta replicación se realiza por un complejo multienzimatico dondeintervienen enzimas y proteínas sin actividad enzimatica.
La duplicación es un proceso en el cual una secuencia de nucleótidos delADN es copiada, sintetizándose dos cadenas complementarias con nucleótidos conbases complementarias.
Este proceso necesita que un nucleótido no polimerizado aun, reconozca sucomplementario en la cadena con nucleótidos ya polimerizados. Para que elloocurra se necesita que se separen las cadenas. Este mecanismo permite elenfrentamiento de los nucleótidos no polimerizados con sus complementarios.Este proceso permite el inicio de la polimerización.
Para comenzar la apertura de la hélice actúa una enzima llamada helicasa(topoisomerasa II), que utiliza ATP para poder actuar a lo largo de la cadena.
La hélice a pesar de estar formada por interacciones no covalentes es muyestable, es por ello que para abrir dicha hélice mediante la acción de laenzima helicasa, son necesarias además, unas proteínas llamadas “proteínasdesestabilizantes” o SSB.
Estas proteínas se ubican como en caravana a lo largo de la cadena de nucleótidosde una forma muy particular, dejando libres las bases de nucleótidos para quepuedan ser reconocidos por las bases de los nucleótidos que se complementaran yformaran la nueva cadena.
A medida que la hélice se desenrolla comienza a existir una presión pordelante de la abertura que hace girar al ADN. Este giro requeriría gasto deenergía para que no se produzca la ruptura de las hebras de ADN. Para evitareste fenómeno actúa una enzima que sigue a la abertura de la hélicedenominada topoisomerasa; esta tiene como función romper y reparar las unionesfosfodiester y así evitar el giro. A esta enzima se la denomina nucleasareversa. De esta forma se desarrolla el ADN y permite que actúe la enzimapolimerizante.
La polimerización del ADN se origina en sitios llamados regiones de origen,en los cuales actuarían algunas proteínas poco caracterizadas llamadas proteínasde iniciación que indicaría el punto de origen para el comienzo de la acciónde la helicasa y la polimerasa.
La polimerización se realiza por una enzima llamada ADN polimerasa que usacomo sustratos a los desoxinucleotidos trifosfatos.
Cada cadena es copiada formándose cuatro cadenas, donde dos de ellas ya estánpreviamente polimerizadas y son las llamadas cadenas molde o templados, a esteproceso de duplicación se lo llama semi-conservativo.
Las cadenas de ADN están enfrentadas de manera tal que el comienzo de unacadena de polímeros tendrá un extremo 3´ del azúcar y en el otro extremo 5´.La cadena que se enfrenta y es complementaria, tendrá en el extremo 3´de laprimera cadena, el extremo 5´ y en el otro extremo 5´ tendrá el 3´. En otraspalabras las cadenas de polímeros van en dos direcciones una de 3´ a 5´ y laotra de 5´ a 3´. Es por ello que se las denomina antiparalelas.
La ADN polimerasa solo puede polimerizar en sentido 5´-3´. Ello representaque una cadena se puede copiar directamente pero la otra necesitara de un polímeropequeño de ADN que se denomina primer o iniciador. La ADN polimerasa usa comosoporte para polimerizar los desoxinucleotidos a este primer.
Este pequeño polímero esta formado por la acción de una enzima llamada ARN polimerasa ADN dependiente.
Los desoxinucleotidos que se van a polimerizar por la acción de la ADNpolimerasa, luego de la síntesis del cebo, se formarían en fragmentos. Estefenómeno fue descubierto por Okasaki, de allí que los fragmentos se denominenfragmentos de Okasaki. De manera tal que una de las cadenas estará copiada enfragmentos a los cuales se los debe unir y además eliminar los pequeñosribonucleótidos usados de cebo.
La síntesis de ADN se inicianormalmente en muchas regiones llamadas puntos de origen de replicación y losmismos se encuentran en cada cromosoma. La iniciación de esta síntesis estacontrolada por la Activacion de las proteínas quinasas dependientes de ciclina.La replicación se origina endiferentes sitios pero además cada origen de iniciación se activa a diferentestiempos en regiones del cromosoma que se organizan en el espacio en forma declusters dentro del núcleo. La replicación se produce solo una vez por elciclo celular, o sea que se origina de una sola copia los cromosomas y no seproducen nuevos sitios de origen de replicación hasta no haber finalizado elciclo.
En los sitios donde se generan sitios de origen, generalmente se encuentranen la secuencia del ADN regiones ricas en A/T. Existen unas secuencias llamadasARS-binding factor (ABF-1), luego se identificaron dos complejos denominados ORCque esta formado por 6 polipéptidos y se denomina multiprotein originrecognition complex. Otra proteina descripta involucrada en los mecanismos deiniciación es la denominada replication protein A. Es una proteina que esfosforilada durante la fase S del ciclo celular por Activacion de las quinasasdependientes de ciclina.
Cual es la señal que da lugar a la interacción de este tipo de proteínascon el ADN? Aparentemente durante la mitosis se produciría la permeabilizacionde la membrana nuclear para dar lugar a la penetración en el núcleo de unfactor denominado “licensing factor” necesario para que se produzca la unionde los complejos proteicos con secuencias de ADN y dar lugar a la formación denuevos y múltiples sitios de iniciación.
La enzima o los complejos enzimáticos que finalmente dan lugar a lareplicación del ADN son los formados por unas enzimas llamadas ADN polimerasas.La función de estas enzimas es la de adicionar nucleótidos para formar unacadena de ADN, comenzando por un pequeño grupo de nucleótidos o base llamadoprimer. A su vez tienen la capacidad de reparar un error cambiando un nucleótidoincorporado erróneamente.
Se han realizado estudios estructurales en dos polimerasas, una denominadaFragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. Coli y la transcriptasa reversa delvirus HIV-1 del SIDA.
La ADN polimerasa de Klenow normalmente usa como templado al ADN. Latranscriptasa reversa puede usar ADN o ARN. Ambas enzimas tienen asociado undominio que presenta actividad de nucleasa, pero este dominio tiene funcionesdiferentes en ambas enzimas. En la Klenow la región de nucleasa sirve parareparar errores en la introducción de nucleótidos. Mediante este sitio lapolimerasa saca el nucleótido erróneamente agregado por la misma enzima. Esuna actividad de 3´-5´exonucleasa. En el caso de la transcriptasa reversa estaactividad de nucleasa sirve para romper la union entre el ARN que usa comotemplado y el ADN sintetizado. También son diferentes en su estructura 4ª. LaKlenow es un monómero y la transcriptasa reversa es un dimero formado porsubunidades de diferente tamaño.
La estructura de la Klenow muestra que es una proteina constituida por dosdominios bien definidos. Uno largo c-terminal conteniendo una hendidura o huecoy otro mas pequeño globular en el amino-terminal. La actividad de exonucleasaesta localizada en el dominio amino-terminal, mientras que el sitio activo depolimerasa se encuentra en el dominio c-terminal. Este sitio a su vez puede serdividido en 3 dominios denominados “palm, fingers y thumb”. El subdominiopalm contiene estructura de hoja beta plegada y contiene al sitio catalítico.El subdominio fingers esta compuesto por estructuras de alfa hélice y eldominio thumb contiene dos cadenas alfa hélice paralelas de gran longitud. Sehan descripto además lugares de interacción o binding sites para metalesdivalentes en la región de exonucleasa como así también en la región catalíticade polimerasa. Los iones que interaccionan son de Mg, Mn o Zn.
La estructura de la transcriptasa reversa, la cual puede emplear ADN o ARNcomo templado dando híbridos de ADN-ARN o duplicados de ADN, se puede presentarcomo un heterodímero formado por una subunidad de 66 kDa y una de 51 kDa,encontrándose la actividad de polimerasa en la subunidad de 66 kDa. Estatranscriptasa tiene un dominio con actividad de ARNasa denominado ARNasa H yesta localizado en un dominio separado de la actividad de polimerasa ylocalizado en la región c-terminal.
El sitio activo de ambas polimerasas esta localizado en la región denominadapalm, contiene el sitio catalítico, la región que une por el sitio 3´terminal la cadena donde se van polimerizando los nucleótidos tambiéndenominada primer. Esta región contribuye a la union del nucleótido a seragregado. Esta región es la mas conservada de todas las polimerasas.
La nomenclatura de las ADN polimerasas se puede encontrar indicado con letrasgriegas por ejemplo, ADN polimerasa a, dy e, también conocidas comopolimerasas I, II y III, respectivamente. Existen otras ADN polimerasasdescriptas, por ejemplo b, enlevaduras, aunque su acción no seria en los procesos de replicación sinomutagenesis, haciendo by pass en los sitios damnificados del ADN.
De todas las ADN polimerasas en eucariotas, la delta es la mas conservadadesde levaduras a humana. Las polimerasas también tienen actividad deexonucleasas, en el caso de la polimerasa delta ambas actividades residen en lasubunidad de mayor tamaño.
La polimerasa epsilon humana también tiene dos subunidades, pero en estecaso la subunidad catalítica tiene 225 kDa y la restante 50 kDa. Su función esdesconocida. Esta polimerasa tiene su acción principalmente en la reparaciónde ADN, sin embargo, esto no descarta que a su vez actúe en los procesos dereplicación. Esta polimerasa también interviene en el control de los checkpoints en la fase S, actuando como sensor para la replicación, transmitiendo señalesinhibitorias para prevenir procesos transcripcionales inapropiados durante estafase del ciclo celular. Estas dos funciones residen en diferentes dominios de laproteina; en el amino terminal se encuentra la actividad de polimerasa y en elcarboxilo terminal la función de control de check point.
La distribución de las polimerasas es asimétrica y se sabe que los erroresen la replicación pueden estar inducidos por error en la distribución de lasproteínas o concentración de nucleótidos en estos sitios.
En los últimos años se han descripto una serie de factores accesorios a lasADN polimerasas que pueden dividirse en tres grandes clases: a) proteínas quese unen al ADN como cadena simple; b) factores de reconocimiento entre eltemplado (cadena de ADN) y el iniciador o primer y c) factores de procesamiento.Dentro de estos factores se puede mencionar una proteina denominada RP-A, cuyoequivalente en levadura es RV-A. Esta compuesta 3 subunidades y es requeridatanto para la iniciación como para la elongación de la cadena de ADN. Estaproteina es fosforilada y la fosforilación en al menos una de sus subunidadestiene un papel fundamental en este proceso.
Otro factor es el llamado PCNA y su papel es esencial durante la replicacióndel ADN. Esta identificado como un factor auxiliar de la polimerasa delta. Estefactor interacciona con una proteina denominada p21, que es un inhibidor de laproteina p53, proteina relacionada a los genes supresores y relacionadas a lacascada de las proteínas quinasas dependientes de ciclinas.
Otro factor el RFC (llamado factor de replicación C) es una proteina que uneATP y tiene actividad ATPasa, siendo esta actividad máxima cuando se produce lainteracción del iniciador o primer con el templado.
Expresión de la Información Genética
La expresión de la información genética involucra la traducción de unasecuencia lineal de nucleótidos de ADN en una secuencia colineal de aa.
La copia del ADN dando lugar al ARNm se denomina transcripción y la copiadel ARNm en una secuencia lineal de aa se denomina traducción.
La translación de la secuencia nucleotidica de ADN en proteínas se basa enun código de triplete de nucleótidos.
Cada triplete, llamado codon, codifica para un único aa; existiendo 4 basesy expresándose como tripletes se forman 64 (43) posibles codonespara codificar solo 20 aa, o sea que para cada aa hay mas de un codon, esto sedenomina código redundante.
Algunos de los codones tienen funciones especiales: AUG codifica parametionina e inicia la traducción de todas las proteínas, hay 3 codones definalización de traducción que son UAA, UGA y UAG.
ACIDOSRIBONUCLEICOS (ARN)
La transcripción da lugar a la formación de tres tipos de ARN, mencionadosel mensajero, el ribosomal y el de transferencia.
Los ARNs son de simple cadena y las bases que los constituyen son: adenina,guanina y citosina; uracilo.
Las moléculas de ARN se sintetizan en el núcleo (algunas formas sesintetizan en la mitocondria) y son exportadas al citoplasma, mientras que lasproteínas que tienen función enel núcleo se sintetizan en el citoplasma y son importados al núcleo.
El núcleo esta cerrado por una envoltura que consiste en un par de membranasconcéntricas. La membrana externa se continua con la membrana del RE y elespacio perinuclear, entre la membrana externa y la interna se continua el lumendel RE.
El intercambio de los materiales se realiza a través de los poros nucleares.
ARNm
El ARNm es tipo especial de ARN en el cual la secuencia nucleotidica delmismo es complementaria a una de las cadenas del ADN. Existen en el ARNm unconjunto de tripletes de nucleótidos llamado codon que provee la informaciónespecifica para reconocer un aa.
ARNt
Estos ARNs son pequeñas moléculas cuya función es la de actuar comotransportadores intracelulares de los aa hacia los ribosomas como síntesisproteica. De los 20 aa que se encuentran en las proteínas, cada uno de ellostiene por lo menos un ARNt que lo transportara específicamente. Algunos aapueden ser transportados por mas de un ARNt.
ARNr
Al ARN ribosomal constituye cerca del 65% de la masa ribosomal. En células eucariotas existen 4 tipos de ARNr, cada uno identificado,cada uno identificado por su coeficiente de sedimentación como 5S, 7S, 18S y28S.
transcripción
El ARNm es traducido a una proteina en una serie de reacciones catalizadaspor un gran complejo llamado ribosoma.
Los aa utilizados para formar la proteina son transportados hacia el ribosomapor el ARNt que representaría el lápiz siguiendo el ejemplo grafico.
Los ARNt presentan una estructura tal que cada 3 nucleótidos del ARNmexisten en el ARNt otros 3 nucleótidosque se reconocen en forma complementaria. Este reconocimiento se realiza a travésde las bases de ambos ARN.
Para que se produzca la expresión de estos genes en forma especifica ydiferencial existen unas unidades denominadas de y tanscripcion, que dan lugar ala formación de transcriptos específicos llamados transcriptos primarios.
La unidad de transcripción es una región del gen que contiene una señalpara la generación del transcripto primario. Principalmente esta unidad detranscripción debe contener un sitio de iniciación y uno de terminación de latranscripción. El producto de esta unidad de transcripción son los ARNs quedarán lugar a la síntesis proteica.
Un fragmento de ADN que servirá para que finalmente se sintetice unaproteina, previa formación del ARNm, esta formada por varias regiones cada unacon una función especifica a saber:
1) Una región de control
A la misma se le atribuye la función de controlar el incremento de latranscripción. Estas secuencias de control tienen características muyinteresantes como por ejemplo:
- Están formadas por 300 a 500 pares de bases con secuencias repetitivasen su cadena con independencia funcional.
- Pueden actuar a distancia del sitio de iniciación.
- No necesariamente se encuentran por delante del sitio de iniciación dela transcripción.
Estas dos secuencias están involucradas en la union e iniciación de latranscripción.
3) El punto de iniciación de la transcripción
Este punto depende de la presencia de un promotor. La función que cumpliríael promotor seria señalar el punto de inicio de la transcripción.
4) Los exones
Son secuencias de nucleótidos que darán lugar a la transcripción de losnucleótidos con bases complementarias para la formación del ARN.
5) Los intrones
Estas secuencias se hallan intercaladas entre las secuencias codificantes.Estas secuencias también son transcriptas pero luego se pierden en la etapa demaduración del ARNm.
6) Una secuencia AAUAAA, un punto de poliadenilacion y una señal determinación
Inmediatamente terminada la transcripción una enzima denominadapoliA-polimerasa efectúa un corte y poliadenilacion del extremo 3´, usando ATPcomo sustrato. Esta enzima agrega entre 100 y 200 residuos de ácido adenilico.Esta adición esta dirigida desde el lugar donde se halla la secuencia AAUAAA.La eliminación o mutación de esta secuencia evita la poliadenilacion. Lapoliadenilacion se realiza antes de que el ARN salga del núcleo.
Todavía no se conocen los mecanismos de terminación de la transcripción ocuales serian las secuencias que determinan que la enzima encargada de la síntesisde ARN (polimerasa) se desacople de la unidad de transcripción.
En las células de organismos eucariotas se han encontrado 3 tipos diferentesde polimerasas. Cada una de estas polimerasas son enzimas encargadas desintetizar un tipo de ARN. La polimerasa llamada de tipo I es la encargada decatalizar la transcripción del ARNr. Se encuentra en el nucleolo y es laencargada de producir alrededor del 50 al 70% de la transcripción nucleolartotal.
La polimerasa tipo II que se halla en gran parte asociada a la cromatina esla responsable de la formación del ARN precursor del mensajero. Este ARNprecursor también se denomina heterogéneo. El tercer tipo de polimerasa tipoIII es la encargada de sintetizar ARN pequeños incluyendo la fracción 5S delribosoma.
En el proceso de transcripción para que se produzca la síntesis de ARN porapareamiento de nucleótidos por intermedio de sus bases, en primer termino sedeben separar las cadenas de ADN. Ello sucede en el punto de union de la ARNpolimerasa y requiere la presencia de una secuencia determinada de nucleótidosque como describimos anteriormente se denomina promotor. Luego se produce laelongación de la cadena de ribonucleótidos, donde los mismos son adicionadospor acción de la polimerasa, formándose uniones covalentes adicionándose apartir de la cadena por el extremo 3´avanzando la polimerasa en sentido 3´-5´.Por delante de la polimerasa las hebras de ADN se van desenrollando y por detrásde la polimerasa se van enrollando. Cuando la polimerasa reconoce el sitio deunion de terminación se agrega el ultimo ribonucleótido y el transcripto sedesacopla liberándose la polimerasa y volviendo el ADN a su configuraciónoriginal de doble cadena en forma helicoidal.
Cuando se conocieron los mecanismo de transcripción y traducción se planteola interrogante de cual fue la primer molécula existente el ARN o el ADN, dadoque para el inicio de la síntesis de proteínas se necesitan enzimas y lasenzimas son proteínas.
En experimentos muy recientes se ha comprobado que el ARN puede presentaractividad enzimatica, sobre todo para la formación de los enlaces entre aa. Deahí que se haya elaborado la siguiente hipótesis para la explicación de laaparición de los organismos.
Se postila que aparentemente se sucedieran una serie de eventos que, en lasecuencia del tiempo, se pueden exponer en 4 etapas:
1) Formación de polímeros de ARN capaz de dirigir su propia replicación.
2) Desarrollo del mecanismo por el cual el ARN de lugar a la síntesisproteica.
3) Formación de una membrana lipidica que contenga a la mezcla de ARN yproteínas.
4) Desarrollo del mecanismo por el cual se forme el ADN capaz de conservarla información que transmitía el ARN y de esta manera conservar la informacióny la especie ante cualquier destrucción de los ARNs.
Resulta fundamental para el entendimiento del funcionamiento de un organismotener el conocimiento de los elementos que dan lugar a la duplicación del ADN,a la transcripción con formación del transcripto primario y se realiza antesde que los mismos abandonen el núcleo. El primer proceso es la adición en elextremo naciente de un 7-metilguanilato. Esta adición se realiza con una union5´-5´trifosfato.
A este proceso se los denomina adición de la caperuza o camping.
El segundo proceso es el de poliadenilacion y extracción de las secuenciasno codificadas transcriptas por los intrones. A este proceso se lo denomina“de corte y empalme o splicing”.
El mecanismo de corte y empalme en el ARNr lo realiza el propio ARN. En esteproceso no intervienen enzimas y se conoce que el propio ARN tiene la capacidadde realizarlo sin gasto de energía con ganancias y perdidas de unionesfosfodiester.
El ARNt también sufre el proceso de corte y empalme, pero a diferencia delribosomal, este proceso se realiza por acción de una endonucleasa. Esta enzimarealiza dos cortes en el extremo de intron transcripto para luego actuar unaligasa y unir los dos extremos.
El ARNm es acortado en forma diferente y por un proceso que involucra aribonucleoproteinas. Estas se unen por complementariedad de bases a secuenciasconservadas entre los nucleótidos transcriptos por intrones y exones. Como pasointermedio en esta reacción se forma una estructura en forma de lazo en la cualel extremo 5´ se pliega sobre si mismo cerca del extremo 3´. Estas secuenciasque se localizan en los puntos de corte serian las principales determinantes delos puntos de corte y empalme. Se denominan secuencias consensuales y son lassecuencias que se conservaran en la mayoria de los genes. La mutación de una deestas secuencias llevara a la síntesis proteica anormal.
Uno se podría preguntar porque se transcriben los intrones si luego en elproceso de maduración se cortan y solo se empalman los exones. Pues bien, notodos los intrones transcriptos se cortan y algunos siguen en el ARN, siendoreconocido que la función de los mismos seria regular el pasaje de los ARN delnúcleo al citoplasma. Otra función importante de los intrones es aparentementela de delimitar o estar entre las uniones de exones que darán lugar a la síntesisde dominios funcionantes en las proteínas.
Este proceso de corte y empalme tiene una función biológica muy interesanteque se ha observado en la síntesis de IG. De un mismo transcripto se puedenempalmar exones transcriptos no necesariamente contiguos. Esto trae comoconsecuencia que de una sola transcripción se puedan sintetizar proteínasdiferentes con funciones diferentes. A este mecanismo se lo denomina “empalmealternativo” (splice alternativo).
Luego de la maduración del ARNm que abandona el núcleo representa entre el1 y 2% de las secuencias presentes en el ADN.
La regulación de la transcripción esta dada tanto al inicio como al finaldel proceso.
Nosotros conocemos que una correcta expresión de genes,en un tiempo correcto, es el evento que dará identidad a cada célula. Comomencionamos anteriormente, existe una secuencia de ADN denominada promotor quedeterminara el sitio exacto de inicio de la transcripción para un gendeterminado y además, también los niveles de ARN. El core de los elementos quecomponen el sitio promotor contiene la TATA BOX y los elementos iniciadores.Ellos se encuentran cercanos e inmediatamente después hacia la región 5´ delpunto de inicio o sitio de iniciación de la síntesis de ARN. Casi todos losgenes tienen un nivel mínimo de transcripción que esta dado por una maquinariamínima de transcripción. Además la región promotora contiene sitios dereconocimiento para factores de transcripción. Estas son secuencias especificasen el ADN que unen proteínas. Estos sitios pueden activar (enhancer) o reprimir(represor) la transcripción.
Los activadores desde el punto de vista funcional,parecen ser proteínas que interaccionan con el ADN por sus dominios ácidos,ejemplificados por residuos ricos en glutamina o prolina. Los represores sonmenos conocidos desde este punto de vista, pero parece que principalmente seencuentran en los dominios ricos en alanina.
La base de acción de estos activadores y represores, esla interacción proteina-proteina y su consiguiente interacción con secuenciasespecificas en el ADN.
Dentro de los factores de transcripción para la mayoríade los promotores, los primeros identificados fueron los denominados TFII,conociéndose 8 de ellos denominados: TFII A, B, C, D, E, F, G y H. Estosfactores actúan en la iniciación de la transcripción generado por la acciónde la ARN polimerasa II. Estos factores se unen en la región del promotorconocido por secuencias ricas en A y T, llamada TATA box y guardan una secuenciatemporal de union, siendo aparentemente el TFIID el primero en interaccionar conla región TATA, luego interaccionaría el TIFA, TFIIB y TFIIF.
La TATA box o los elementos iniciadores también sonreconocidos por un componente del TFIID denominado proteina de union de la TATAbox (TBP). Esta proteina actúa con la ARN polimerasa I y II. La TBP es uncomponente integral de la maquinaria de transcripción.
Existe un grupo de proteínas que actúan junto al TBP yse denomina TAF. Se postula que los activadores se unen secuencialmente en eltiempo para activar la transcripción vía la interacción con el TBP y losfactores asociados a TBPs o TAFs.
Existen otros factores llamados adaptadores, queconceptualmente no difieren de los TAFs y actuarían sin necesidad de reconocerel ADN, pero si al TBP como parte de los mecanismos de Activacion de latranscripción. Dentro de estos adaptadoresexiste una proteina llamada CBP que se une a un factor de transcripción CREB yes denominada CREB-binding protein. El primer CREB-binding protein factorcaracterizado fue el CREB pero luego se han caracterizado por lo menos diezfactores mas, comprobándose que estos factores pertenecen a una familia degenes con características similares. Son los siguientes: todos ellos pertenecena la clase de factores detranscripción denominados bZIP, característicos por tener entre 4 a 6leucinas. En algunos, la histidina puede reemplazar a la leucina. Estos factorespueden heterodimizarse, pueden sufrir cambios por splicing y pueden actuar comoactivadores o represores. Estos factores contienen sitios de fosforilación paraPK A, C y quinasa de caseína. Estos sitios una vez fosforilados pueden regularla actividad de CREB. Estos factores pueden ser regulados a través de laActivacion de PKA dependiente de AMPc.
Otra familia de factores es la denominada CREM, que tieneun papel muy importante en la rta nuclear al AMPc y tiene mucha importancia enla fisiología neuroendocrina.
Después de la transcripción de ADN en ARN, este ultimoes procesado antes de salir del núcleo. En este proceso las regiones que nocodifican (los intrones) desaparecen. De esta forma solamente la informacióncontenida en los codones de los exones es usada para formar la secuenciaaminoacidica. Después que los intrones son eliminados continua el proceso demaduración del ARN pasa la citoplasma para ser traducido en proteina.