Los métodos para la obtención de preparaciones histológicasocupadas en los estudios de microscopia óptica, se engloban en la TécnicaHistológica. La Técnica Histológica abarca varios procedimientos a los que sesomete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo uncubre objeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajomicroscopia óptica o electrónica.

Los procedimientos de la Técnica Histológica se resumen enlas etapas siguientes:

Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una MUESTRA DELTEJIDO a estudiar y existen 2 formas:

 

• Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.

   

   

• Biopsia:(del griego bios = vida y oasis = visión) Examen u obtención de tejido de un organismo vivo. Puede ser inscisional, excisional, por sacabocado, por punción y absorción, por raspado, por trepanación.

   

Este proceso se refiere al tratamiento del tejido consustancias químicas que tienen varias finalidades:

 

1. Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo.

    

    

2. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.

    

    

3. Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.

    

    

4. Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.

    

Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que deotra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POSTMORTEM.

La fijación mantiene las estructuras al estimular la formaciónde enlaces cruzados entre las proteínas.

Los agentes más usados para Microscopia de Luz son:

 

• Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.

   

   

• Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.

   

   

• Es el más usado es el Formol al 10%.

   

 

• Funcionan formando enlaces transversales en las proteínas y manteniendo las estructuras de la célula.

   

   

• El fijador de Bouin es una solución que contiene 75 ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico, 25 ml de formol y 5 ml de ácido acético glacial.

   

   

• El líquido de Helly es una solución con 2.5 g de bicromato de potasio, 5 g de cloruro de mercurio, 100 ml de agua y 5 ml de formol.

   

 

• Precipitan las proteínas.

   

Para Microscopia Electrónica se usan:

 

• Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el formaldehído, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.

   

   

• Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con el haz de electrones.

   

   

• Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a pH 7.4, evita la violenta desnaturalización de las proteínas guardando detalles finos de la célula. Es el más usado en Microscopia Electrónica.

   

 

• La mejor fijación es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación.

   

   

• Tamaño de la Muestra

   

   

• El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual de va a utilizar.

   

Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijadory se deshidrata.

Debido a que una gran parte del tejido está constituida poragua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor amayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona.Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solución de 60%, 70%, 80%, 90%,96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua.Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% dealcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.

Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución deuna sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusióna utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusiónParafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. Dela misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, elXilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejidose torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índicede refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo comomedios de aclaramiento.

A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finospara ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos yenvueltos por una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas paraeste fin son: gelatina y parafina.

El objeto de la inclusión es:

 

• Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.

   

   

• Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.

   

La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida ocualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve elmedio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca lamuestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C,colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo latemperatura a 60º C.

Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y losespacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina.Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel ometal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándoseun bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque sele denomina Taco.

Los medios de inclusión para Microscopia Electrónica comúnmenteutilizados son resinas polimerizadas o epoxi como:

 

• Epon

   

   

• Mikropal

   

   

• Araldit

   

El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientementedelgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparadospara microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros. Paraestos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.

Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen enel proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamientode la inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de Tejidos.Un tejido congelado, es los suficientemente duro para ser cortado.

Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquidopara tener una congelación rápida. Luego se corta con un aparato especialdenominado MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un aparato más elaborado yeficiente para los cortes de congelación llamado CRIOSTATO. La ventajade esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos, se puedeutilizar en el diagnostico de material patológico, tomado en intervencionesquirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación.

Para Microscopia Electrónica se requieren cortes másdelgados (denominados ultra finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. deespesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CONHOJA DE VIDRIO O DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre rejillas decobre con un diámetro de 3mm.

Los cortes todavía no son aptos para su examen con elmicroscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecende color.

Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les haagregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa comoadhesivo.

La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo seincluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie degraduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100%de agua.

Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes másutilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA. Una vez teñido, sedeshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente elCUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gotade Bálsamo de Canadá o similar). Los medios de montaje pueden ser miscibles ono miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria ladeshidratación después del teñido, se puede montarlo directamente. Elcubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se requiere para observar elcorte con un microscopio.

Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:

 

• Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.

   

   

• Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriza extracelular.

   

   

• Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos.

   

Laminilla Histológica: Superficie plana y delgada endonde se encuentra montada una preparación de tejido permanente. Se compone detres partes:

 

• PORTAOBJETOS

   

   

• CORTE O TEJIDO

   

   

• CUBREOBJETOS

   

La EOSINA es un colorante ácido y sus propiedadestintoriales pueden ser explicadas sobre la base de lo que se sabe acerca de laacción de las anilinas ácidas. La HEMATOXILINA aunque no esun colorante básico, posee propiedades muy semejantes a las anilinas básicas.

Un colorante básico es una molécula de anilina que tieneuna o más cargas positivas en su porción coloreadas y su fórmula general serepresenta:

Los COLORANTES BÁSICOS reaccionan con los GRUPOSANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los grupos fosfato de losácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de losglucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacciónde estos grupos varía según el pH.

Como ya se menciono, la Hematoxilina no es un colorante básicoen sentido estricto. Se la utiliza con un Mordiente (Intermediario),entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la coloracióncon hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante básico. Launión en el complejo TEJIDO – MORDIENTE – HEMATOXILINA, no consiste en unsimple enlace, y cuando la Hematoxilina se coloca en agua no se disocia deltejido, sino que permanece firmemente adherida. A causa de esto, la Hematoxilinase presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue laEosina u otros colorantes ácidos.

Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse ensecuencia en donde el colorante básico es seguido por uno ácido, por que laanilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados posterioresen soluciones acuosas.

Un COLORANTE ÁCIDO lleva una carga negativa en laporción coloreada de la molécula y su fórmula general se representa:

Los colorantes ácidos se unen primariamente a loscomponentes texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similarpero opuesta a la de los colorantes básicos. Las anilinas ácidas reaccionancon grupos catiónicos, como los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas.

Cualquier componente de los tejidos que reaccione con uncolorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO yque presenta BASOFILIA. Estos componentes son:

 

• La Heterocromatina y los Nucleolos del Núcleo por los grupos Fosfato ionizados.

   

   

• Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.

   

   

• Matriz del Cartílago por grupos Sulfato ionizados.

   

Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidosse dice que son ACIDÓFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Sonacidofilos:

 

• La mayor parte del citoplasma no especializado.

   

   

• Filamentos Citoplasmáticos.

   

Todos estos debidos a grupos Amino ionizados.

 METACROMASIA

Es el fenómeno por el cual un colorante (por ejemplo Azulde Toluidina o la tionina) cambia de color tras reaccionar con un componentetextural.

Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES,la molécula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorciónson diferentes de las propiedades de las moléculas individuales. Se interpretaque la metacromasia refleja gran cantidad de cargas aniónicas muy cercanas unasa otras en el tejido, una situación prevalerte en la sustancia fundamental delcartílago y en los gránulos de los mastocitos, el Azul de Toluidina tiñea estos de color púrpura.

Los componentes titulares que pueden colorearse metacromáticamente,denominados Cromotropos, son principalmente los glucosaminoglucanossulfatados y las nucleoproteínas.

El Reactivo de Schiff es la leucofucsina o bisulfatode fucsina. Es incoloro, pero puede formar un color rojo estable producto deadición con grupos aldehído. Este compuesto se utiliza en combinación conotros productos químicos como:

El Método del ácido peryódico-Schiff (PAS) seemplea para determinar la presencia de moléculas como el glucógeno,glucoproteínas y glucosaminoglucanos.

Lo que hace es romper la unión de los anillos de las hexosasformando grupos aldehído o rompen los enlaces de las hexoaminas de losglucosaminoglucanos, también formando grupos aldehído y haciéndolosreaccionar a estos grupos con el reactivo de Schiff. También sirve paraidentificar membranas basales y fibras reticulares.

El Método de Feulgen este es un método especificopara la determinación histoquímica del DNA, donde la hidrólisis ácido débilcon cloruro de hidrógeno (HCl) se separan los grupos púricos del DNA. De estemodo se abre el anillo de desoxirribosa, y se forma un grupo aldehído quereacciona con el reactivo de Schiff. Se obtiene un color magenta o rojo. Nose tiñe el RNA.

Luego de la fijación con formalina se realizan cortes porcongelación, por lo que se evita extraer los lípidos con los solventes orgánicos.

Para la determinación histoquímica se emplean muy a menudolos denominados COLORANTES SUDÁN. Estos son casi insolubles en agua. Elcolorante Sudán se emplea disuelto en un solvente orgánico en el cual los lípidossean relativamente insolubles, y en el que también el colorante sea sóloparcialmente soluble. Además, el colorante debe ser más soluble en lípidosque en el solvente, puesto que la coloración tiene lugar porque las moléculasdel colorante se distribuyen entre los lípidos y el solvente en relación consu solubilidad en ambos. Para evitar la extracción del colorante y los lípidos,luego de la coloración se montan los cortes en medio acuoso.

Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los TRIGLICÉRIDOS,como por ejemplo:

 

• ROJO DE SUDÁN O SUDÁN III, EN LA COLORACIÓN DE CÉLULAS ADIPOSAS.

   

   

• EL NEGRO DE SUDÁN O SUDÁN IV, SE EMPLEA EN LA COLORACIÓN DE LAS VAINAS MIELÍNICAS DE LAS FIBRAS NERVIOSAS COMPUESTAS POR LIPOPROTEÍNAS.