Los aminoácidos, péptidos y proteínas son componentes importantes de losalimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la síntesisproteica. Por otro lado, los aminoácidos y péptidos contribuyen directamenteal sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromáticos y lassustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones térmicas y/o enzimáticasque ocurren durante la obtención, preparación y almacenamiento de los mismos.
Aminoácido. Los aminoácidos son ácidos carboxílicos que contienen un grupoamino. Existen unos cien en la naturaleza. En el hidrolizado total de las proteínasexisten veinte aminoácidos que tienen, con algunas excepciones, la fórmulageneral siguiente:
R-CH-COOH
NH₂

En el caso más sencillo, el radical R es un átomo de Hidrógeno (ácidoaminoacético o glicina), en los demás aminoácidos R es un resto alifático,aromático o heterocíclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales.
Existen diez aminoácidos, denominados aminoácidos esenciales, que el organismoes incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentación. Elorganismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario paraelaborar los cetoácidos correspondientes; se ha comprobado que si se lesuministran éstos y sales de amonio es capaz de elaborarlos.
Los aminoácidos constituyentes de las proteínas son, aproximadamente, veinte:alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico,glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
Todos ellos son aminoácidos excepto dos, que son iminoácidos, laprolina y la hidroxiprolina, que también pueden considerarse como aminoácidospor su similitud estructural. Se les llama aminoácidos porque el grupo aminoestá unido al carbono de la cadena que es, por convenio, el átomo de carbonoadyacente al grupo carboxilo.
Los aminoácidos contienen tantos grupos ácidos como básicos, por lo quetienen propiedades ácidas y básicas débiles y se les llama anfolitos. Secomportan como anfipróticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las moléculasde aminoácidos transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da comoresultado una carga total nula, esta forma se conoce como "zwitterion"del aminoácido. La carga total transportada por un aminoácido depende del pHde la solución y de los valores de la constante de acidez de los gruposionizables presentes. Si el pH es mucho mayor que el valor de la constante de ungrupo, se libera un protón y la molécula tendrá una carga negativa, pero siel pH es menor, tendrá carga positiva. El hecho de que a diferentes valores depH el aminoácido tenga distintas formas y lleve distintas cargas netas seutiliza en muchos métodos analíticos, como en la electroforesis y en lacromatografía de intercambio iónico. El punto iso-iónico de una molécula esel pH en el que el número de cargas negativas debidas a los protones perdidoses igual al número de cargas positivas debidas a los protones ganados, entoncespredomina la forma zwitteriónica. El punto isoeléctrico es el pH en el que lasmoléculas no presentan migración en un campo eléctrico y puede determinarseexperimentalmente por electroforesis; en los aminoácidos es igual que el puntoiso-iónico.

Un aspecto importante en el análisis de los aminoácidos es el hecho de queno se pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionancon los aminoácidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, portanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o cuantitativos. Esto es loque se denomina derivatización de los aminoácidos. Los métodos fluorimétricostienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometría para el análisis deaminoácidos.
Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para fijar las necesidadeso exigencias en proteínas para el ser humano. Por ello se establece una"proteína de referencia" o "patrón".
Conocida la composición en aminoácidos de las proteínas de los distintosalimentos que se consumen y cuales han demostrado poseer mayor valor biológico,a saber: la de la leche, la del huevo y las de la carne; y teniendo en cuenta lacomposición cuali-cuantitativa en aminoácidos, se ha adoptado dicha"proteína de referencia" o "patrón".

En la calidad de las proteínas influye el contenido en aminoácidosesenciales, y es importante la presencia de "limitantes". En efecto,se llama así al aminoácido esencial que en una proteína dada se encuentra encantidad relativa más baja con respecto a la proteína patrón porque limita elaprovechamiento de esa proteína a los fines biológicos.
Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en conjunto, para estimarel grado de proteólisis enzimática que ha sufrido el producto, así como laproporción de cada uno de ellos, como componentes de la proteína, cuando sedesea establecer su valor biológico.
La determinación de aminoácidos en alimentos permite extraer algunasconclusiones acerca de su composición; por ejemplo, la gelatina usada comoespesante se diferencia rápida y sencillamente, de otros hidrocoloides (grasasvegetales, almidón, etc.), en función de su composición aminoacídica.

Objetivos.
En primer lugar recogemos los distintos métodos oficiales y estándares para elanálisis de aminoácidos en alimentos, encontrados en Métodos Oficiales de Análisiseditados por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (1986) y enMethods of Analysis of AOAC (1995), así como algunos métodos recomendados.
Posteriormente, en la discusión, tratamos sobre las distintas técnicas deseparación (cromatográficas y electroforesis), del analizador automático deaminoácidos, de los distintos reactivos derivatizantes y el tipo de detecciónapropiada para cada uno, y las ventajas y desventajas de la derivatización,tanto antes (precolumna) como después (postcolumna) de la separación.

Métodos oficiales.
Determinación de prolina en miel.
Reacción de la prolina con ninhidrina en medio ácido y posterior determinacióna 517 nm de la absorbancia del compuesto formado.
Preparación de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panelpor escurrimiento a través de un filtro de luz de malla, optaremos por realizarel siguiente paso, la homogeneización. Reblandecer la muestra calentando entre25-30ºC agitándola al mismo tiempo. Una vez homogeneizada se calienta a 50ºCal baño María hasta que se consiga la fusión y se deja enfriar rápidamente.

Determinación de hidroxiprolina en carnes.
Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de lahidroxiprolina. El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valoracolorimétricamente a 560 nm..
Preparación de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectorasdel producto para poder tomar una muestra representativa. Se parten trozos de0,5 - 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeños cubos. Después se pasan poruna trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla homogénea. Se guarda enfrascos limpios y secos para prevenir la pérdida de humedad. Se conserva enrefrigeración de forma que evite su deterioro y cualquier cambio en sucomposición.

Métodos estándares.
Determinación de prolina en miel.
Determinación de hidroxiprolina en carnes.
Determinación de aminoácidos en preparados vitamínicos.
Determinación de lisina en suplementos nutricionales.
Los grupos amino de las proteínas reaccionan con DNFB dando lugar a losderivados lisina-DNFB. Posteriormente se produce una hidrólisis ácida y ladeterminación en un analizador de aminoácidos de la lisina.

Determinación de triptófano en alimentos.
La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se realiza un ajuste depH. El triptófano es separado por cromatografía líquida de intercambio iónicoy determinado por un detector UV a 280 nm.

Determinación de aminoácidos sulfurados en alimentos (metionina y cisteína).
En primer lugar las proteínas son oxidadas con ácido perfórmico paraconseguir ácido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrólisisácida con HCl. Realizamos una cromatografía de intercambio iónico aplicándoleun detector que sea capaz de medir a 570 nm.

Métodos recomendados.
Análisis de aminoácidos por HPLC seguido del método del fenilisotiocianato.
(Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins).
A continuación, incluimos un protocolo típico del análisis de aminoácidos enharinas:
- Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad enevaporador rotatorio.
- Añadir agua y evaporar a sequedad.
- Realizar el examen cromatográfico de una solución problema al 10% de lamuestra tratada en solución - acuosa de isopropanol a 10%.
- El sistema solvente: n-butanol/Hac/H₂O en proporción 12:3:5.
- Soporte papel Whatman nº1.
- Longitud del papel 50 cm.
- Método cromatográfico descendente.
- Duración: 12 horas.
- Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%.
- Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC.
- Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos.

A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individualesde una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de laestructura de las proteínas.
El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuadospara averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidospresentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisiscuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.

Cromatografía en capa fina.
Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servircomo guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizarseparaciones por cromatografía de líquidos en columna. Proporciona una idea rápidade los aminoácido mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de esteprocedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. Dehecho, algunos cromatografistas son de la opinión de que los ensayos en capafina deberían preceder siempre al uso de la columna
En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra,lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para suposterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en laidentificación de un constituyente desconocido de la muestra.
Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias queinterfieren, tales como proteínas, carbohidratos
y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidosretenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeñovolumen de amoniaco y lavando después con agua destilada.
La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de mododiferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente serealizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de laplaca cromatográfica en el eluyente que será succionado por acción de lasfuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.
La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de R_f(factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desdeel origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otrostomados como referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas dedisolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado deseguridad.

La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegirun disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejorresolución de los componentes ácidos, básicos o neutros. En general,aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan todos losvalores de R_f e introduciendo pequeñas cantidades de amoniacoaumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunosdisolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringesu uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitarel rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente.Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos.
El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarseempleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventesdistintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmentepara la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente eltriple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión.Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ángulo de 90ºy se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en elreactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos dimensiones, lacomposición de los dos disolventes es la que determina el orden en que debeutilizarse.
Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número deaminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidadsimilar en la primera dimensión se separan en la segunda. Ésto es muy útil enla detección de los componentes que están en muy baja concentración y puedenquedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración altacuando se utiliza la cromatografía en una dimensión.

Electroforesis.
La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículascoloidales) se separan en función de su distinta velocidad de migración en uncampo eléctrico. Desde los años cincuenta, las separaciones electroforéticasfueron la piedra angular de gran parte de la investigación de químicos y biólogosmoleculares relacionada con la separación y análisis de proteínas, polinucleótidosy otros biopolímeros. Estas separaciones han sido (y continúan siendo) muyeficientes y de una extensa aplicación, pero por desgracia, son unas técnicasmuy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles.
A mediados de los ochenta, esta situación cambió espectacularmente con laaparición de aparatos comerciales para realizar electroforesis analíticas amicroescala en columnas capilares (electroforesis capilar).
El hecho de que los distintos aminoácidos transporten diferentes cargas netas aun pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis dealto o bajo voltaje. Los medios utilizados más frecuentes como soporte son elpapel o las placas de capa fina (celulosa o gel de sílice), pudiéndoseutilizar para visualizar las manchas, los reactivos de localización quedescribiremos más adelante. Las separaciones se pueden realizar más fácilmentecon alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de laprimera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan enmenor extensión la calidad del electroforetograma.
A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforéticas con támponesa distintos pH, en la práctica los valores de pH escogidos están entre 2 y5’3. A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga positiva y los de tipo básicoque tienen la mayor carga positiva migran más rápidamente hacia el cátodo,mientras, que a pH 5 los aminoácidos se dirigen hacia ambos electrodos,dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 5’3 se utilizanpara determinar la naturaleza ácida o básica de un aminoácido desconocido.

Cromatografía de gases.
Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad queofrece la cromatografía de gases, pero aunque se han realizado considerablesprogresos en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de formarutinaria para el análisis de aminoácidos en muestras biológicas. La razónde ésto radica en el hecho de que los aminoácidos, aunque similares, soncompuestos químicamente heterogéneos y además no son suficientemente volátilesa menos que se conviertan en algún derivado apropiado. Aparecen dificultades nosólo a la hora de elegir el método de obtención de tales derivados, sinotambién en la selección de una fase estacionaria que sea capaz de resolver losderivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lohora de elegir el detector aparecen también problemas similares.

Analizador automático de aminoácidos - HPLC.
Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos a través decromatografía líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y cromatografíade intercambio iónico.
La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separaciónmás ampliamente utilizada. Las razones más importantes son su sensibilidad, sufácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidadpara la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, sugran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria,en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplosde estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos yotros.

Cromatografía de reparto en fase reversa.
La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmentepolar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada ligada como faseestacionaria. Algunas de las ventajas más sustanciales de esta alternativa sonsu gran reproducibilidad, tiempos de retención cortos, velocidad de muestreoalta, sistema cromatográfico simple y amplio campo de aplicación. Por todoello, las aplicaciones son cada vez más numerosas.
La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y lafase móvil, ya sea de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno omediante equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fasemóvil (ácido-base, formación de complejos o pares iónicos, adición decomplejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los isómeros ópticos,etc.).

Cromatografía de intercambio iónico.
La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficacespara la determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambioiónico.
Existen métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidosy otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC modernaempezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación porintercambio iónico se retraso debido a la inexistencia de un método general ysensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos,y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió en1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la técnica desupresión del efluente, la cual hace posible la detección conductimétrica delos iones eluídos. El analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo lacuantización de los aminoácidos se basa en esta técnica.

Analizador automático de aminoácidos. La separación de aminoácidos fue elprimer proceso cromatográfico automatizado con derivatización post-columna. Laseparación fue llevada a cabo por Moore, Spackman y Stein (1958), mediante unintercambio iónico, seguido de su cuantización de cada componente eluido de lacolumna por reacción con ninhidrina y posterior detección en el visible. Estemétodo se ha realizado durante más de treinta años, en cualquier laboratoriode proteínas.
El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunasmodificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombeartampones de pH o de fuerza iónica variables, a través de una columnatermostatizada. Entre las novedades está la fabricación de resinas de altacalidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatización sofisticados y unaumento en la sensibilidad de los métodos de detección.

La separación tiene lugar en una columna de resina de poliestirenosulfonado. Inicialmente el pH de la fase móvil es bajo, por lo que los aminoácidoscargados positivamente se verán atraidos por los grupos sulfurosos ( SO₃^-). Conforme se va aumentando el pH del támpon los aminoácidos se eluyendiferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anión.A pH 3.5 los aminoácidos con un grupo ácido extra, de su cadena tendrán muypoca afinidad por la resina y serán los primeros en salir de la columna,mientras que los que tengan un grupo extra ionizable capaz de transportar unacarga positiva (e.g. lisina, histidina) serán retenidos fuertemente por laresina y se eluirán sólo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se hayareducido su carga neta positiva.
Además del pH también hay que considerar la concentración del tampóneluyente, pues influye en la elución de tal modo que cuando la concentraciónde ion aumenta en mismo, los aminoácidos se eluyen más rápidamente.

Las interacciones no iónicas entre los aminoácidos y la resina tambiéninfluyen en la secuencia de elución, permitiendo que algunos aminoácidos quetienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada.
La resolución cuantitativa de mezclas de aminoácidos se consigue variando lacomposición del támpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante laconcentración, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menossignificativos en la calidad de la separación como son la temperatura, lavelocidad de flujo del tampón o el tipo de catión utilizado.

Aspectos prácticos del analizador:
Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar losaminoácidos ácidos y neutros y otra para los básicos. Las de vidrio o aceroinoxidable dan picos estrechos y altos, mejorando la separación de aminoácidosimilares.
Solución tampón: suele ser citrato sódico o de litio, al que se le añade undetergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dosdisoluciones tampón, una ácida y otra básica. Se mezclan en proporcionesvariables para conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la separacióndisminuyendo el tiempo de análisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas dela linea base debidas a cambios repentinos en el tampón, como sucedia conanteriores técnicas.
Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionizaciónde los aminoácidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas queimplica un cambio de ésta en diversos momentos del proceso.
Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampón constante para permitir lareproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presión o de desplazamientoconstante.
Detección: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante(generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna.Cuando la reacción ha tenido lugar, la corriente se controla en una célula deflujo de un colorímetro o un fluorímetro. Se mide la absorbancia continuamentea 570 y 440 nm. para detectar los amino e iminoácidos respectivamente.
El análisis aminoacídico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay unúnico sistema de separación para problemas analíticos, sino que de la eleccióndel sistema apropiado depende el problema analítico. Por ejemplo, de la matrizen la cual los aminoácidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada yen la velocidad requerida para el análisis.
Los actuales métodos de detección para aminoácidos dependen de la reaccióndel grupo amino primario del aminoácido para formar un derivado coloreado ofluorescente, esta derivatización tiene lugar tanto antes como después de quela separación de los aminoácidos haya sido efectuada. La menor variedad detipos de aminoácidos en comparación con las estructuras de los péptidos haceque los modos de HPLC disponibles para el investigador sean la cromatografía deintercambio catiónico (CEC), y la cromatografía de fase reversa (RPC). Lacromatografía en fase reversa es más apropiada para la separación dederivados aminoacídicos que para aminoácidos libres.
La elección de HPLC está limitada por la elección del agente de derivatizacióny/o la decisión de usar tanto pre- como post-columna de derivatización, dehecho, algunos de los más interesantes descubrimientos llevados a cabo en laseparación de aminoácidos por HPLC reside en el desarrollo y optimización denuevos agentes de derivatización. Reacciones muy rápidas como la derivatizacióncon fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) están siendo empleadas en aumento conel clásico método de la ninhidrina.

El problema de la derivatización de aminoácidos está concentrado en ladetección selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestradisponibles son muy pequeñas, ya sean proteínas cuya estructura vaya a serdeterminada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia,de modo que la reacción de derivatización debería permitir la detección enel rango del pmol.
La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Deberíaocurrir cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminoácido,el reactivo no debería interferir. Es probable que la derivatización genereproductos que son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la altaselectividad de separación de los sistemas cromatográficos implica queraramente haya problemas. La derivatización precolumna puede ser llevada a caboautomáticamente inmediatamente antes de la separación.
La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidadinstrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan seroptimizados para alcanzar sensibilidad de detección más alta.

OFtaldehido (OPA).
El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a laninhidrina en la postcolumna de derivatización y suministró un significanteincremento en la sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA enpresencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando uncompuesto fluorescente. La separación en fase reversa seguida de detecciónfluorescente constituye un método de detección rápido, sensible y selectivopara todos los aminoácidos con grupos amino primario. Los péptidos son menosreactivos que los -aminoácidos y las aminas secundarias no reaccionan.
Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para postcolumnas dederivatización ahora está ampliamente usado como un agente para precolumnas.Mientras que la separación de aminoácidos siguiente a una precolumna dederivatización está llevada a cabo por cromatografía de fase reversa, ambas,cromatografía de fase reversa y cromatografía de intercambio catiónico puedenser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatización en la postcolumna.

Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados,quizás añadida a los problemas de cuantización, aunque ésto no es de grandificultad en la técnica de derivatización en postcolumna. Sin embargo, enprecolumna y desde el punto más bajo de pH 7’2 hasta un pH típico de reacciónde 9’5, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistemacromatográfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reacción y sirve paraestabilizar ligeramente los productos de reacción. La mayor desventaja del OPAes que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque éstopuede ser solventado con su oxidación por cloramina-T o hipoclorito. Una estratégicacombinación del uso de OPA con FMOC (9-fluorenilmetil cloroformato) ha sidorecientemente introducida para solucionar esta deficiencia.

El método con OPA se utiliza específicamente con precolumna de derivatizaciónpara el análisis de aminoácidos porque es más sensible y tarda menos tiempoque otros métodos HPLC.

Fluorescamina.
La fluorescamina fue también introducida como una posible alternativa a laninhidrina en postcolumnas de derivatización. Todas las aminas primariasreaccionan con la fluorescamina en medio básico (pH 9-11) dando un productofluorescente con un incremento en sensibilidad de detección mayor que laninhidrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. Elproducto fluorescente es inestable en disolución acuosa y el reactivo debeprepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que seconviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse conN-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interéspor su rápida velocidad de reacción con los aminoácidos a temperaturaambiente, la reacción no es tan sensible como la de la ninhidrina.

Isotiocianato de fenilo (PITC).
El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado parala secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisisde aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente másusado para precolumnas de derivatización, seguido de cromatografía en fasereversa, en análisis de aminoácidos, siendo empleado para mezclas de aminoácidosde una gran variedad de fuentes.
En lugar de ser analizados como derivados de PTH (feniltiohidantoin), comoocurre durante la secuenciación de péptido o proteínas, los aminoácidos sonanalizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). Así, a pH alcalino, losaminoácidos primarios y secundarios producen derivados de PTC, que pueden serregistrados por absorbancia UV (240-255 nm) con un límite de detección en elrango de 5 a 50 pmol. Todos los aminoácidos forman derivados mono-PTC, exceptolisina y cisteína, que producen dobles formas PTC. Los productos sonrelativamente estables, aunque alguna conversión al derivado PTH puede ocurrirsi el pH no se controla adecuadamente.
Aunque la metodología PITC puede ser considerada superior al resto de las técnicasen un gran número de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunosderivados PTC de aminoácidos son fuertemente afectados por la presencia dealgunas sales, cationes divalentes, metales e iones tampon. Así, mientras elacetato amónico, el cloruro sódico y el borato sódico se ha encontrado que notienen efecto en aminoácidos PTC, otras sales, como el fosfato de sodio y elbicarbonato de sodio si que lo tienen. Además la contaminación por trazas deiones metálicos se ha encontrado que reduce la formación de aminoácidos PTC.Incluso añadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para laderivatización.

Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo.
El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonilo) fueinicialmente introducido para el análisis del nitrógeno terminal de los aminoácidosen péptidos y proteínas, un propósito para el cual todavía es empleado.Reacciona con aminas primarias y secundarias para producir derivadosfluorescentes. Su aplicación adolece de la presencia de numerosos productoslaterales y de la formación de múltiples derivados de ciertos aminoácidos.Además de ésto está el requerimiento de un largo tiempo de reacción. Así,aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadorespara la derivatización en precolumna seguida de cromatografía en fase reversa,este método nunca ha sido ampliamente aceptado para el análisis automático deaminoácidos.
El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetilaminoazobencenosulfonilo) es un agentemuy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla porChang y sus colaboradores, para la detección de aminoácidos en el rango delvisible y en el nivel del pmol. Reacciona con aminoácidos primarios ysecundarios para producir derivados que tienen una gran absorbancia en el rangodel visible. La reacción se realiza a unos 70ºC y un pH de 8 a 8’5,produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 minutos. Se forman mono ybis-derivados de lisina, tirosina e histidina.

A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente dederivatización, la técnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancialimitada a la presencia de sales, y aun no está clara cómo se vería afectadala detección a altos niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por lapresencia de metales, sales y otros contaminantes.
Aunque no se usa ampliamente en análisis automáticos de aminoácidos como laninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptación comercial del método del clorurode dabsilo está disponible en Beckman Instruments.

Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl).
El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamentefluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todavíausado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue primeramenteaplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis de aminoácidos.El FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperaturaambiente para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienenuna fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- ybis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas deestos derivados varían en función del pH y de la proporción de reactivo yaminoácido.
Durante la reacción con FMOC-Cl, los productos de hidrólisis del reactivo quese forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacídicos.Estos productos interfieren en la separación por cromatografía de fase reversaa menos que sean eliminados por el disolvente orgánico de extracción, antes deaplicar la muestra a la columna de cromatografía de fase reversa. Una versiónautomatizada de este procedimiento de derivatización ha sido desarrollada ycomercializada.
Betnér y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la eluciónde grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrólisis, FMOC-OH, que son eluídosen la misma región cromatográfica que muchos de los aminoácidos FMOC, porderivatización del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofóbica. Elderivado resultante es eluído más tarde en el cromatograma después de todoslos aminoácidos FMOC.
Una combinación entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizadorcomercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reacción de aminoácidosprimarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reacción deprolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinación de la fluorescencia paralos derivados de aminoácidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a caboentonces a longitudes de onda apropiadas.

7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F).
Reactivos de derivatización basados en la estructura del nitrobenzofurazan,NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones específicas en el análisisde todos los aminoácidos.
El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un agente fluorigénicopara aminas, incluyendo aminoácidos y posteriormente Rot como una útilherramienta para el análisis de aminoácidos, particularmente por su realzadareactividad con aminas secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenidoempleo ocasionalmente para la detección de aminoácidos, con particular énfasisen la detección de prolina e hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a laderivatización en pre- y post-columna, con un límite de detección en éstasúltimas de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un límite de detección enlas primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite una detecciónsensible de aminoácidos, reacciona algo más despacio con aminas y no ha tenidoun uso extendido como agente analítico general para aminoácidos.

NBD-F es más reactivo que su análogo de cloro, permitiendo una derivatizaciónmás rápida, acompañada de una gran fluorescencia para prolina ehidroxiprolina. De forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto aderivatizaciones precolumna como postcolumna. Los límites de detección para laprecolumna están definidos en el rango de 5-15 fmol para la mayoría de losaminoácidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado ampliamente como método analíticopara aminoácidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivohabitualmente.

Otros reactivos derivados del isotiocianato.
El 4’-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usadosatisfactoriamente en la secuenciación manual y análisis de nitrógenoterminal de péptidos y proteínas. La degradación tipo Edman de péptidos yproteínas efectuada por este agente produce derivados tiohidantoin coloreados(DABTH), que pueden ser separados por cromatografía de fase reversa. El métodode degradación generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con DABITCy luego con PITC. La 4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC(DANABITC) ha sido también aplicada con éxito, aunque en menor grado que elDABITC.
Difenilindenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizadacuando la espectrometría de masas por ionización química es acoplada conidentificaciones previas por cromatografía de fase reversa. La detección dederivados de tiohidantoin (DITH) se lleva a cabo por determinación UV (en elrango por debajo del pmol). La detección electroquímica es un utensilioalternativo.
Otros reactivos isotiocianatos de derivatización precolumna son4-(t-butiloxicarbonilaminometil)fenil isotiocianato (BAMPITC, detecciónfluorescente), trimetilsisil isotiocianato para análisis de secuencia decarbono terminal (detección UV) y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI)como una instrumento electroquímico para el análisis de aminoácidos.

Reactivos mixtos.

Otros reactivos están siendo continuamente desarrollados y utilizados paradetecciones de aminoácidos. Algunos tienen aplicaciones muy específicas ylimitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para ampliosusos en sistemas automáticos. Tales reactivos incluyen el ácido2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) y su análogo 2,4-dinitrobenceno (DNBS),N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido1,1-difenilbórico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (reactivo deMarfey). La detección fluorescente es posible cuando se emplean reactivos talescomo pentano-2,4-diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril,2,3-naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida -naftilcarbamato,3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido, 9-hidroximetilantraceno e isotiocianatofluorescente y 1-naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente,4-isocianatoftalhidrazida, también ha sido investigado. Con excepción delpentano-2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado en derivatizaciónpostcolumna seguida de intercambio iónico HPLC de aminoácidos, todos los demásfueron utilizados para la derivatización previa de cromatografía de fasereversa.
En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes características de losreactivos de derivatización más importantes para la determinación de aminoácidos:

Preparación de las muestras. La reacción con losderivatizantes forma el mismo cromóforo con las aminas primarias que con lassecundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lípidos antesde que tengan lugar la hidrólisis y los pasos de derivatización. La mayorcausa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatización es lapresencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no-volátiles,detergentes y lípidos. Las sales y los támpones interfieren tanto en la hidrólisiscomo en la posterior derivatización, distorsionan la cromatografía y añadenpicos extra al cromatograma.
Las sales pueden ser eliminadas de las proteínas y de los péptidos usando támponesvolátiles y HPLC de fase reversa, precipitación, diálisis o columnas defiltración de gel.

Las opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de laderivatización antes o después del HPLC, de aminoácidos serán determinadaspor los requerimientos de la aplicación específica. Factores como lasensibilidad requerida en la detección, cantidad de muestra disponible, tipo demuestra, fuente de muestra, velocidad de análisis y reproducibilidad e inclusoconsideraciones económicas influirán en la elección entre la derivatizaciónpre- o post-columna de aminoácidos.
Derivatización post-columna. La derivatización siguiendo a una cromatografíade intercambio catiónico de aminoácidos libres tiene distintas ventajas, contal de que la instrumentación produzca velocidades y temperaturas de reacciónreproducibles. Además, para la derivatización no es necesario proceder alcompleto, y los problemas de estabilidad del derivado son insignificantes. Otrasventajas son que la automatización es fácil y que el tiempo consumido y la pérdidaa causa de la preparación de la muestra son innecesarias. También pueden serusados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sidoadquiridas del tradicional método de intercambio catiónico y tinción conninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separaciónexcelente de mezclas complejas de aminoácidos y sus metabolitos.

Una desventaja con un sistema HPLC convencional es que son necesariosinstrumentos más complejos que para el método de pre-columna. La derivatizaciónpost-columna requiere la adición de una o más bombas para los disolventes yreactivos derivatizantes. También se requiere la adición de un reactorpost-columna, el cual llevará a un ensanchamiento de banda adicional, y poresto, un decrecimiento en la sensibilidad de detección. La columna de eluciónes continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descensoen la sensibilidad de detección. Así, la máxima sensibilidad alcanzable porderivatización post-columna será menor que en el caso de la precolumna.

Derivatización pre-columna. Ésta, acoplada con cromatografía de fasereversa en lugar de con cromatografía de intercambio catiónico, fueoriginalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayorsensibilidad y mayor velocidad de análisis. Las ventajas de la metodología dela derivatización pre-columna incluyen simplicidad, velocidad y altasensibilidad. Por ello, si se requiere máxima sensibilidad de detección, unreactivo fluorescente combinado con la derivatización pre-columna es el métodomás indicado.
Como desventaja está la necesidad de garantizarse la completa reacción delreactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separación porexceso de reactivo, el medio de reacción o la producción de diferentesderivados de un componente. Además, la estabilidad del derivado puede ser unimportante factor durante la derivatización pre-columna, la demora entre laderivatización y la inyección llega a ser fundamental para los resultadosobtenidos.

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